天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性调查

徐赟霞 杨凯 王禹 冯守明

摘 要：采用K-B纸片扩散法和微量稀释法对从天津地区养殖的南美白对虾（Penaeus vannamei）中分离的弧菌进行耐药性调查，结果显示2020年在养殖季节从天津市患病的南美白对虾中共分离出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、创伤弧菌7株、霍乱弧菌3株。在天津市南美白对虾以副溶血弧菌污染最为严重，约占总数的45%左右。药敏结果显示分离的33株弧菌对2种及2种以上药物耐药的有27株，约占总数的81.8%，说明天津地区弧菌已经出现了多重耐药的现象;通过对33株弧菌对药物的MIC值测定，33株弧菌对恩诺沙星、氟甲喹和盐酸多西环素比较敏感，对磺胺类药物比较耐药。结果提示应加强对天津地区南美白对虾弧菌病主要病原菌耐药性监控。

关键词：南美白对虾（Penaeus vannamei）;弧菌;耐药性

南美白对虾（Penaeus vannamei），又称凡纳滨对虾 、白脚虾，原产于中、南美洲太平洋沿岸水域，是目前世界上养殖产量较高的品种之一[1]。南美白对虾作为优质水产养殖品种，因其营养丰富、味道鲜美，深受天津市市民的喜爱，同时也为广大养殖户带来了可观的经济效益。随着对虾养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，受外界的因素和人为的影响，南美白对虾养殖病害频繁发生，给养殖户带来严重的经济损失[2]。弧菌是一种条件致病菌，当养殖水环境恶化或者其他因素影响，会使对虾体内机能平衡关系被打破，原来不致病的正常菌群中的细菌可成为致病菌。南美白对虾细菌病的主要原因是弧菌病[1]，能够引起虾类等大量死亡。

在天津市发生上述疾病时常以药物防控为主，主要应用抗菌药物进行灭菌，药物治疗成为防治养殖水生动物细菌性疾病的重要手段。但由于天津市南美白对虾养殖中以小户、散户居多，大部分养殖户在病害的防治上多是猜测着用药、试着用药，目前随着治疗水产养殖中细菌病的抗菌素类药物使用剂量的加大，使细菌产生了耐药性。很多细菌从原来的单一耐药发展为多重耐药，且耐药性还有扩大的趋势，抗菌素类药物残留于水生动物食品中，给水产品质量安全带来巨大威胁。为此，本研究主要对天津市南美白对虾弧菌病主要病原菌的耐药性进行调查，推进天津市对虾养殖过程中抗菌药物的精准使用、减量使用，遏制水生动物病原菌耐药性的扩大趋势，保障天津市水产品质量安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在养殖季节收集天津地区养殖的行动缓慢、生长迟缓、患红体病等不健康的南美白对虾作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离 在无菌条件下，用接种环蘸取南美白对虾肝胰腺接种于TCBS选择培养基上，划线分离后将培养皿至于恒温培养箱中，于28 ℃±1 ℃培养24 h后，挑取单菌落，划线接种于营养琼脂（NA）平板，纯化后备用。

1.2.2 病原菌的生化鉴定 采用法国梅里埃公司生产的VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统对病原菌进行生化特征分析。

1.2.3 药敏试验

1.2.3.1 弧菌的药物敏感性测定 采用K-B纸片扩散法，将培养24 h的新鲜菌落用0.85%的无菌生理盐水洗下，制成1.5×108CFU/mL的菌悬液，用灭菌的棉球蘸取菌悬液后均匀涂布于MHA平板，待菌悬液被培养基吸收后，再用灭菌镊子取药敏纸片，分别贴于接种了细菌的MHA培养基表面，倒置放于28 ℃恒温培养箱中培养24 h后，用直尺量取抑菌圈大小。结果判断参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准[3]。药敏纸片购自Oxoid公司，在有效期内使用。抗菌药物的药敏纸片含量、药敏实验判定标准见表1。

1.2.3.2 病原菌最低抑菌浓度的测定 采用稀释法测定抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC），采用药敏板对病原菌进行恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶等8种药物MIC的测定，药敏板购自南京菲恩医疗科技公司。使用ATCC25922大肠埃希氏菌作为质控菌株。

1.2.4 数据统计方法 使用SPSS软件对MIC50、MIC90进行统计。

2 结果与分析

2.1 弧菌在天津市南美白对虾中的分布情况

2020年在养殖季节从天津市不健康的南美白对虾中共分离出弧菌33株，經生化鉴定，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、创伤弧菌7株、霍乱弧菌3株。在天津市南美白对虾以副溶血弧菌污染最为严重，约占总数的45%左右。

2.2 病原菌药物敏感性测定

对33株弧菌进行药物敏感性测定，结果见表2，从表2中可以看出，33株弧菌对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星等比较敏感，对新霉素、阿莫西林等耐药。其中只有1株（3.0%）弧菌对所有抗生素都敏感，对1种抗生素耐药的有5株（152%），对2种抗生素耐药的有12株（303%），对3种抗生素耐药的有10株（363%），对4种抗生素耐药的有5株（15.2%）。

2.3 病原菌最低抑菌浓度的测定结果

33株弧菌对8种抗菌药物感受性测定结果见表3和图1，从表3中可以看出33株弧菌对恩诺沙星、氟甲喹和盐酸多西环素比较敏感，其MIC90分别为2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6548 μg/mL;其对磺胺类药物比较耐药，MIC90超过512 μg/mL;其对硫酸新霉素和甲砜霉素相对耐药，MIC90分别为175.778 μg/mL和111.6 μg/mL。

3 讨论

弧菌广泛存在于自然界内，可以与养殖动物共存，不会引起疾病，但是当养殖南美白对虾水环境恶化、受伤、体弱、抗病力降低等，弧菌会乘虚而入，便会引起南美白对虾发生严重疾病，甚至死亡[4]。2020年在天津市宝坻区周边养殖的患病南美白对虾中共分离出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株，约占总数的45%左右，说明在天津市南美白对虾细菌病中以副溶血弧菌污染最为严重，这与江艳华[5]等报道相一致，尤其在夏秋季节容易暴发流行。

當前天津市南美白对虾养殖发生细菌性疾病时，药物防治仍然是主要的治疗手段。为了防治疾病，不少养殖户在饲料中长期添加抗菌药物。在发生疾病的时候，养殖户盲目乱用、滥用抗菌药物，造成了细菌耐药性的产生，而且耐药程度不断提高，甚至出现了多重耐药现象，危害严重。本研究考察了从天津市患病的南美白对虾分离出的弧菌对常用的八类抗生素的耐受情况，结果显示，分离的33株弧菌对2种及2种以上药物耐药的有27株，约占总数的81.8%，说明天津地区弧菌已经出现了多重耐药的现象;在此基础之上我们又测定了33株弧菌对8种药物的MIC值，33株弧菌对恩诺沙星、氟甲喹和盐酸多西环素比较敏感，其MIC90分别为2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6.548 μg/mL;对磺胺类药物比较耐药MIC90超过512 μg/mL。本试验结果可为天津地区养殖南美白对虾过程中出现的弧菌病用药提供理论支撑。

综上所述，在天津地区养殖南美白对虾过程中由于抗菌药物的不合理使用，已使大量弧菌产生了耐药性，而且已经出现了多重耐药的现象。细菌耐药性的产生多是由于抗生素选择的结果，在水产养殖过程中，细菌的耐药性可通过耐药质粒的转移将耐药性进行传递，而水产养殖又具有扩散性和流动性等特点，因此水产动物细菌将耐药性传播给人类致病菌潜在危险极大[6]。为了降低南美白对虾弧菌耐药性，可以采取以下几种方式：在饲料中添加免疫制剂，提高对虾抗病力，减少疾病的发生[7];在治疗疾病时，从患病动物体内分离病原菌进行药敏试验，根据药敏试验结果选药，不可盲目选择抗菌药物;定期对养殖南美白对虾体内携带的致病菌进行耐药性监测，掌握养殖水体和南美白对虾体内致病菌对各种抗菌药物的耐药性变化[8];应积极开展水产动物源细菌耐药性监测和研究。

参考文献：

[1]

沈文英，阳会军，尹军霞.南美白对虾的病害及防治研究现状[J].水利渔业，2004，24（1）：58-60.

[2] 陈爱平.2002年我国南美白对虾养殖及病害情况综述（中）[J].科学养鱼，2003（11）：41-42.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，29th informational supplement Nccls document [M]100-S15.Wayne：NCCLS，2019：1-243.

[4] 黄美珍，李志棠.微生态制剂在虾病防治应用的研究进展[J].中山大学学报 （自然科学版），2000（S1）：75-79.

[5] 江艳华，姚琳，宋春丽，等.青岛市售贝类副溶血性弧菌污染状况及耐药性分析[J].中国卫生检验杂志，2012，22（2）：375-377.

[6] 施慧，王庚申，谢建军，等.2013年-2014年浙江省海水养殖常见致病菌耐药性分析[J].科学养鱼，2015（4）：54-56.

[7] 高杨.南美白对虾致病性弧菌的鉴定及药敏分析[J].河北渔业，2019（2）：18-20.

[8] 田甜.鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及耐药性研究[D].武汉，华中农业大学水产学院，2010：36-37.

The antimicrobial resistance investigation of Vibrio from Penaeus vannamei in Tianjin area

XU Yunxia， YANG Kai， WANG Yu， FENG Shouming

（Tian Jin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402，China）

Abstract：The antimicrobial resistance investigation of Vibrio was performed by K-B and Microdilution method which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin area.The results showed that 33 strains of Vibrio were isolated from the diseased Penaeus vannamei in the breeding season in 2020， including 15 strains of Vibrio parahaemolyticus， 8 strains of Vibrio alginolyticus， 7 strains of Vibrio vulnificus and 3 strains of Vibrio cholerae.Vibrio parahaemolyticus was the most of them， accounting for about 45% of the total.The drug sensitivity results showed that 27 of the 33 Vibrio strains isolated were resistant to 2 or more kinds of antibiotics， accounting for 81.8% of the total， indicating that multiple drug resistance had appeared in Tianjin.Mics showed that 33 Vibrio strains were more sensitive to enoxacin， flumequine and doxycycline hydrochloride， and more resistant to sulfonamides.The results suggested that it is necessary to strengthen the monitoring of pathogenicity and antimicrobial resistance of Vibriosis which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin.

Key words：Penaeus vannamei; Vibrio;antimicrobial resistance

（收稿日期：2020-12-21;修回日期：2021-01-07）