嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草幼苗生长和抗氧化防御系统的影响

刘 鹏，崔彤彤，孙鹏越，周 雨，张智伟，尉欣荣，呼天明，付娟娟

（西北农林科技大学草业与草原学院，陕西 杨凌 712100）

草坪是园林绿化和城市生态文明建设的重要景观元素。然而，随着城市化不断推进和生态文明建设的加强，高大乔木、灌木及高楼大厦等引起的遮阴环境影响草坪草的正常生长。

前人研究报道，由于高大乔木和楼宇的遮挡，我国一半以上的草坪生长在遮阴环境中[1]。遮阴胁迫改变了草坪的小气候环境，使草坪草在形态结构和生理代谢等方面发生变化，导致草坪的坪用性状和抗逆能力下降[2-4]。因此，研究草坪植物的遮阴逆境适应机制，提高草坪草的耐阴能力，是草坪研究及从业人员亟需解决的瓶颈问题。

目前，对环境友好的和可持续发展的草坪养护管理措施越来越受欢迎和重视。其中，利用接种植物生长促生菌这一生物治理方法来提高植物抗逆能力已经成为学者们的关注焦点。通过对植物–根际促生菌互作的研究发现，根际促生菌不仅可以促进植物生长、增加作物产量，而且还可以提高植物对生物和非生物的胁迫耐受能力，如病虫害、干旱、重金属污染等[5-8]。其中，节细菌属(Arthrobacter)根际促生菌能够提高植物对非生物胁迫抗性[9-11]。最新研究发现，节细菌属的几个菌种如Arthrobacter nitroguajacolicus 和Arthrobacter woluwensis AK1 能够诱导类黄酮类物质的合成及盐胁迫相关基因LAX3 和ST1 的表达，从而缓解盐胁迫对植物的伤害[12-13]。然而，关于节细菌属根际促生菌对草坪草耐阴性的研究鲜有报道。

牧草种质资源与逆境课题组前期通过比较耐阴性强的麦冬(Ophiopogon japonicus)和耐阴性较弱的多年生黑麦草(Lolium perenne)的根际土壤微生物组成和多样性，研究表明嗜冷乳糖节杆菌B7(Arthrobacter psychrolactophilus)菌株在麦冬根际土壤中相对丰度较高，达22.5%。然而，嗜冷乳糖节杆菌B7 对草坪草遮阴胁迫响应的调控机制尚不明晰。基于此，对多年生黑麦草根系接种嗜冷乳糖节杆菌B7，探讨在遮阴胁迫下其调节多年生黑麦草的生理机制，旨在为从根际土壤微生物与植物互作角度出发揭示植物耐阴机理，以及为生产实践中利用根际促生菌提高草坪草的耐阴能力提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

多年生黑麦草品种为博士(Lolium perenne ‘Ph.D.’)，由西北农林科技大学草地工程实验室提供。供试嗜冷乳糖节杆菌B7 菌株购买于中国微生物菌种保藏中心(http://www.biobw.org/)。

1.2 幼苗培养与处理

试验于2017 年9 月 − 11 月于西北农林科技大学进行。多年生黑麦草种子经次氯酸钠消毒后，用灭菌水清洗3～4 次，播种在盛有灭菌的石英砂的一次性塑料培养钵(直径15 cm)中，在植物培养室内培养，光照强度为11 000 lx，光期/暗期：16 h/8 h，温度(23 ± 2) ℃/(20 ± 2) ℃，相对湿度65%/60%。每盆定植6 株幼苗，每隔2 d 浇灌一次灭菌的Hoagland营养液。在培养3 个星期后，进行根际接种B7 和遮阴处理。遮阴处理采用的是遮阴网和日光灯，遮阴梯度为0、20%、40%、60%和80% [用便携式光量子测定仪(上海，STB-02)测定光照强度]，每个处理设置3 次生物学重复。对照组生长在正常光照条件。

1.2.1 嗜冷乳糖节杆菌B7 菌株复活培养及菌悬液制备

冻干菌株于超净台中打开，接种至营养肉汁斜面培养基(蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 m L，牛肉提取物3 g，琼脂15 g；pH 7.0)进行复活培养48 h。挑取单克隆于上述液体培养基中，在25 ℃恒温摇床中培养48 h，转速为200 r·m in−1。之后将1 m L 菌悬液重新接种至200 m L 液体培养基中过夜培养，制备成108cfu·m L−1的菌悬液。

1.2.2 接种与遮阴处理

轻轻剥开表层基质，取5 m L 上述菌悬液接种到供试植株根系周围，接种2 周后进行遮阴处理。遮阴处理4 周后，用灭菌的剪刀剪取叶片，将样品置于液氮中固定30 m in 后，储存在−80 ℃冰箱待后续测定使用。

1.3 测定项目及方法

每个处理随机选取5 株幼苗，测量从茎基部到叶尖的垂直高度，记为株高；从茎基部剪掉地上部枝条，用万分之一天平称量其鲜重；参考李合生[14]中方法测定叶片的相对电导率和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性和H2O2含量采用Veljovic-Jovanovic 等方法[15]；采用Elstner 和Heupel 方法测定超氧阴离子自由基(积累[16]；采用Cakmak 和Marschner 方法对抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)进行测定[17]；采用Foyer和Halliwell 方法对还原性谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)含量进行测定[18]。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0 软件对不同遮阴强度和B7 处理的数据进行双因素方差分析，F 检验显著时用Duncan 法对生物量、株高、电导率、丙二醛、活性氧、抗氧化防御系统相关指标进行多重比较(P ＜0.05)。采用Sigma plot 14.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 遮阴胁迫下接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对多年生黑麦草幼苗生长的影响

遮阴不同程度地抑制了多年生黑麦草幼苗的生长(图1)。随着遮阴强度的增加，其对多年生黑麦草的抑制作用增强，其中以60%和80%遮阴胁迫的抑制作用最显著(P ＜ 0.05)。接种B7 能够有效地缓解遮阴胁迫对多年生黑麦草幼苗生长的抑制(图1A、B)。与未接种B7 相比，在40%、60%和80%遮阴胁迫下接种B7，多年生黑麦草的地上部分生物量和株高分别增加19.42%、21.70%、27.34%和2.68%、4.91%、12.17% (图1)。这一研究结果表明接种嗜冷乳糖节杆菌B7 减轻了遮阴胁迫对多年生黑麦草的生长抑制。

2.2 遮阴胁迫下接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对多年生黑麦草细胞膜稳定性的影响

遮阴胁迫导致多年生黑麦草叶片中相对电导率和细胞膜脂过氧化产物丙二醛含量发生明显改变(图2)。20%和40%遮阴对多年生黑麦草相对电导率无显著影响(P ＞ 0.05)。未接种B7时，60%和80%遮阴胁迫下，其相对电导率和丙二醛含量分别较无遮阴增加 272.41%、369.70%和145.55%、119.23%。接种B7 能够显著降低重度遮阴(60%和80%遮阴)下多年生黑麦草的相对电导率和丙二醛的积累(P ＜0.05)，与60%和80%遮阴胁迫相比，B7+60%遮阴和B7+80%遮阴处理中相对电导率和丙二醛含量分别显著降低65.67%、64.77%和 57.10%、50.50% (P ＜0.05)。然而，在20%和40%遮阴胁迫下接种B7 并未对细胞膜产生显著的保护作用(P ＞ 0.05)。

2.3 遮阴胁迫下接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对多年生黑麦草叶片中H2O2 和 含量的影响

随遮阴强度增加，活性氧的积累表现为逐渐增加的趋势(图3)。与未接种B7 相比，20%和40%遮阴对多年生黑麦草叶片中H2O2和含量的影响不显著(P ＞ 0.05)，而60%和80%遮阴胁迫较无遮阴，H2O2和的积累显著增加(P ＜ 0.05)。接种B7 能够有效降低遮阴胁迫诱导的活性氧的积累，与单独遮阴处理相比，20%、40%、60%和80%遮阴胁迫下接种B7 使得H2O2和含量分别下降5.88%、24.41%、33.60%、40.00%和30.91%、22.94%、25.67%、49.37%。这表明遮阴胁迫下接种B7 有效减轻了多年生黑麦草叶片由于活性氧大量积累而引发的氧化伤害。

图 1 嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草幼苗生长的影响Figure 1 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on p lant grow th of perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

图 2 嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草叶片中细胞膜损伤的影响Figure 2 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on cell membrane damage in perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

2.4 接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草叶片中抗氧化酶活性的影响

图 3 嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草叶片中活性氧积累的影响Figure 3 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on reactive oxygen species (ROS)levels in perennial ryegrass seed lings exposed to shade stress

图 4 接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽转移酶(GR)活性的影响Figure 4 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on the activities of superoxide dismutase (SOD),peroxidase (POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), and glutathione reductase (GR) in leaves of perennial ryegrass under shade stress

如图4 所示，遮阴胁迫对抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX 和GR 活性产生不同程度的影响。遮阴胁迫下SOD 活性表现为先增加后降低的趋势，其中80%遮阴显著降低SOD 活性(P ＜ 0.05)，而B7 处理能够增加80%遮阴胁迫下SOD 活性。POD 活性与SOD 活性呈相反变化趋势，表现为随着遮阴强度的增加先降低后增加，在60%遮阴处理下POD 活性显著增加(P ＜ 0.05)；接种B7 对40%遮阴胁迫下POD 活性的影响不显著(P ＞ 0.05)，但能够显著提高80%遮阴胁迫下POD 活性(P ＜ 0.05) 。CAT 活性随遮阴强度的增加而下降，与对照相比，在80%遮阴强度下CAT 活性显著下降43.16% (P ＜ 0.05)；而B7 处理能够显著提高80%遮阴胁迫下CAT 活性(P ＜ 0.05)，20%遮阴胁迫对CAT 活性的影响未达到显著差异(P ＞ 0.05)。80%遮阴胁迫下接种B7 导致CAT 活性与其单独遮阴处理相比增加78.33%(P ＜0.05) 。与无遮阴相比，APX 活性在20%和40%遮阴胁迫下逐渐增加，而在60%和80%遮阴胁迫下则显著降低(P ＜ 0.05)。在20%～80%遮阴胁迫下，接种B7 能够有效提高APX 活性。与单独遮阴处理相比，在20%、40%、60%和80%遮阴胁迫下接种B7 导致APX 活性依次增加36.27%、17.59%、205%和200%。与之相似，GR 活性在20%和40%遮阴胁迫下呈现增加趋势，而在60%和80%遮阴胁迫下则呈下降趋势，而且遮阴胁迫下接种B7 能够显著地提高GR 活性(P ＜ 0.05)。

图 5 接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对遮阴胁迫下多年生黑麦草叶片中抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量的影响Figure 5 Effects of Arthrobacter psychrolactophilus strain B7 on ascorbic acid (AsA) and glutathonine (GSH) contents in leaves of perennial ryegrass under shade stress

2.5 遮阴胁迫下接种嗜冷乳糖节杆菌B7 对多年生黑麦草叶片中AsA 和GSH 含量的影响

20%和40%遮阴对多年生黑麦草叶片中AsA含量的影响较小，而与无遮阴相比，60%和80%遮阴胁迫下AsA 含量分别显著增加117.28%和72.19%(P ＜ 0.05)。接种B7 能够显著提高多年生黑麦草中AsA 含量(P ＜ 0.05)，与单独遮阴相比，接种B7 后20%、40%、60%和80%遮阴AsA 含量依次增加136.99%、117.49%、30.22%和37.29%(图5)。除了40%遮阴外，20%、60%和80%遮阴均能够显著提高多年生黑麦草叶片中GSH 含量(P ＜ 0.05) 。与单独遮阴胁迫处理相比，40%、60%和80%遮阴下接种B7 能够显著提高其GSH 含量(P ＜ 0.05)。

3 讨论与结论

乔、灌、草三者相结合的方式常被应运于城市和园林绿化[19]，导致草坪草常处于遮阴逆境中。由高大树木、灌木或建筑物引起的光照不足往往会使草坪草生长瘦弱，对生物与非生物逆境的抗性也随之下降。从而使草坪坪用性质降低[20-21]。研究表明，节细菌属根际促生菌被广泛应用于提高植物对非生物胁迫的抗性[9-13]，比如节细菌属Arthrobacter nitroguajacolicus 和Arthrobacter woluwensis AK1 能够诱导类黄酮类物质的合成及盐胁迫相关基因的表达，从而提高植物对非生物胁迫的抗性[12-13]。嗜冷乳糖节杆菌能合成β-半乳糖苷酶[21]，然而关于嗜冷乳糖节杆菌调控植物非生物胁迫抗性的研究未见报道。本研究发现，遮阴胁迫抑制多年生黑麦草的生长，而接种节细菌属嗜冷乳糖节杆菌B7 菌株能够有效缓解遮阴胁迫对多年生黑麦草生长的抑制。这表明嗜冷乳糖节杆菌B7 能够保护植物免受遮阴胁迫的伤害。这与Khan 等[12]和Safdarian 等[13]研究结果相一致，节细菌属根际促生菌可以提高植物的耐盐能力。

遮阴胁迫与其他非生物胁迫类似，均可诱导植物细胞内活性氧大量积累，从而引发植物体内发生严重的氧化胁迫，导致细胞膜系统受到严重的氧化损伤[22]。因此，逆境条件下相对电导率、膜脂过氧化产物丙二醛和活性氧的积累水平是植物受胁迫损伤的重要体现。本研究结果表明，60%和80%遮阴胁迫导致多年生黑麦草叶片中相对电导率增加及积累较多的丙二醛和活性氧，而接种B7 能够显著降低相对电导率、丙二醛、H2O2和的含量。这表明B7 能够减轻遮阴胁迫对植物造成的氧化损伤，从而提高植物的耐阴能力。

已有研究发现，植物体内抗氧化酶和非酶抗氧化体系在活性氧平衡方面具有重要作用[23]。在植物的氧化防御过程中，SOD 作为解毒活性氧的第1 个关键酶，具有将歧化为H2O2和O2的功能，CAT、POD 及抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环可以进一步清除大量积累的H2O2[24]。本研究结果表明，在一定程度的遮阴胁迫下，接种B7 激活了SOD、POD、CAT、APX、GR 活性，并提高了AsA 和GSH 含量。这表明嗜冷乳糖节杆菌B7 通过提高AsA-GSH 循环效率，诱导多种抗氧化酶活性增加，减轻由于活性氧过量积累而造成的氧化还原失衡。类似的研究指出，接种根际促生菌巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)能够提高植物的抗旱性，与其诱导几种抗氧化酶如SOD、POD、CAT 和APX 活性增强有关[25]。与之相似，Park 等[26]也强调接种植物根际促生菌能够激活多种抗氧化酶的活性，及时地清除过量积累的活性氧，从而提高植物对环境胁迫的适应性。

综上所述，接种节细菌属嗜冷乳糖节杆菌B7能够增强多年生黑麦草的耐阴性，其作用机制主要归因于提高遮阴胁迫下多年生黑麦草的抗氧化系统活性及促进AsA-GSH 循环，从而增加活性氧的清除能力，减轻遮阴引起的氧化损伤。