加味小柴胡汤对哮喘模型大鼠TGF-β1/Smad3 信号传导通路影响的实验研究

米 洋，邓 虎，赵克明

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110847； 2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

哮喘是一种以异质性为主要特征的慢性炎症性气道疾病［1］，由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、气道上皮细胞、中性粒细胞等多种炎性介质参与［2］，随着生活压力、环境、饲养宠物增多，其发病率和死亡率逐年升高［3-4］，吸入性和口服皮质类固醇药物常常作为缓解哮喘发作以及治疗的首选药物［5］。近年来，随着中医事业的发展以及人们对中医药的认可，中医药治疗受到广泛关注。《伤寒论》云：“血弱气尽，腠理开，邪气因入，与正气相搏，结于胁下，正邪分争，往来寒热，休作有时，小柴胡汤主之”“伤寒五六日，中风，往来寒热，胸胁苦满，嘿嘿不欲饮食，心烦喜呕，或胸中烦而不呕，或渴，或腹中痛，或胁下痞硬，或心下悸，小便不利，或不渴，身有微热，或咳者，小柴胡汤主之”。哮喘最常于夜间发作，以干咳为主，这些表现都与条文中提到的小柴胡汤主症相合。有临床观察表明，小柴胡汤能够降低哮喘的复发率［6］。本研究将通过观察气道壁嗜酸性粒细胞浸润程度以及TGF-β1/Smad3 信号传导通路对气道重塑的影响，探究加味小柴胡汤在支气管哮喘发作中的作用，为中药应用于临床支气管哮喘的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠36只，6～8 周龄，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK 辽2019-0001，饲养环境温度22～24 ℃，相对湿度42%～45%。本研究经我院伦理委员会审核通过，同意实施。

1.1.2 实验药物 加味小柴胡汤由黄芩15 g，柴胡15 g，法半夏10 g，党参10 g，甘草10 g，炙麻黄5 g，炒杏仁10 g，紫苏子10 g，大枣15 g 组成，药物饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊，分别煎煮成生药含量0.9 g/mL（低剂量组）、生药含量为1.8 g/mL（高剂量组）［7］，各自混匀，分装备用；地塞米松注射液：广州白云山天心制药股份有限公司，批号：H44022090，使用前将其稀释为0.18 mg/mL溶液备用。

1.1.3 试剂与仪器 卵蛋白（OVA）：美国Sigma公司生产（A8040）；氢氧化铝购自天津化学试剂三厂。超声雾化器：江苏鱼跃医疗设备有限公司生产，型号：402AI。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 将36 只大鼠随机分为空白组、模型组、西药组，中药低、高剂量组及中药联合西药组6 组，每组6 只。

模型制备参照文献［8］，将大鼠适应性喂养1周，除空白组外，其余各组第1 天和第8 天分多点腹腔注射致敏液（OVA+氢氧化铝混悬液），使大鼠致敏。第15 天开始将大鼠放入雾化箱中，予以1%OVA 溶液雾化，隔日1 次，10 min/次，连续雾化4 周。当大鼠出现呼吸急促、呼吸困难、站立不稳等症状时则为激发成功。

1.2.2 给药方法 大鼠模型激发成功开始，各用药组分别给予对应药物进行灌胃治疗，西药组给予地塞米松溶液、中药低剂量组给予生药含量0.9 g/mL 的加味小柴胡汤溶液、中药高剂量组给予生药含量1.8 g/mL 的加味小柴胡汤溶液、中药联合西药组给予地塞米松联合加味小柴胡汤溶液（1.8 g/mL），空白组以及模型组给予用药组同等剂量的生理盐水。灌胃治疗每日1 次，每次给药10 mL/kg，给药时间为实验第16～42 天。

1.3 标本采集与指标检测

将大鼠进行解剖，常规提取肺组织，将部分肺组织置于4%多聚甲醛溶液固定，进行冲洗、透明、浸润、包埋、切片以获取组织切片。

1.3.1 苏木精-伊红HE 染色 取制备好的切片，HE 染色后显微镜下观察肺组织气道壁嗜酸性粒细胞浸润情况，运用图像采集系统、Image J 医学图像分析软件测定各组肺内支气管壁面积（total bronchial wall area，Wat）、支气管平滑肌面积（smooth muscle wall area，Wam）。

1.3.2 免疫组织化学染色 组织片脱蜡水化，放入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中进行抗原修复，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，PBS 冲洗5 min，滴加正常山羊血清封闭处理，28 ℃放置20 min。加稀释好的一抗1 滴，4 ℃冰箱12 h；PBS冲洗5 min，加入二抗工作液，37 ℃恒温水浴锅90 min，PBS 冲洗5 min。DBA 显色，苏木精染色复染细胞核30 s～1 min，树胶封片，晒干。通过显色剂标记抗体的颜色来确定抗原（多肽和蛋白质）的组织和细胞，显微镜下观察到棕黄色染色即为阳性，从而对蛋白质表达进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计软件，连续型变量采用均数±标准差（±s）表示，各组计量资料采用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t 法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织支气管病理学改变

HE 染色后，光镜下观察，与空白组比较，模型组及各用药组肺组织气道壁嗜酸性粒细胞浸润增多，气道管壁增厚，管腔变窄（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组肺组织气道壁嗜酸性粒细胞浸润、气道管壁厚度及管腔宽度均有不同程度降低（P＜0.05）。结果见图1。

2.2 肺组织支气管嗜酸性粒细胞及气道形态参数比较

模型组嗜酸性粒细胞计数、支气管管壁面积、支气管平滑肌面积均明显高于空白组（P＜0.05），各治疗组嗜酸性粒细胞计数、支气管管壁面积、支气管平滑肌面积均低于模型组（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠肺组织气道壁嗜酸性粒细胞、Wat、Warm 比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织气道壁嗜酸性粒细胞、Wat、Warm 比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05

组别 n EOS Wat（μm2） Wam（μm2）空白组 6 0.33±0.52 23.65±2.85 2.15±0.22模型组 6 9.33±1.861） 54.82±5.961） 5.08±0.451）西药组 6 5.00±1.261）2） 31.53±3.721）2） 3.10±0.231）2）中药低剂量组 6 8.00±1.411）2） 42.90±3.341）2） 3.95±0.391）2）中药高剂量组 6 6.67±1.031）2） 37.77±3.721）2） 3.27±0.271）2）中药联合西药组 6 3.67±1.211）2） 27.68±3.221）2） 2.57±0.271）2）F 值 38.392 50.036 60.305 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各组大鼠支气管肺组织TGF-β1蛋白的显色反应

DBA 显色成黄色，模型组通过显色可见TGFβ1、Smad3 蛋白表达水平上升，其余用药组显色可见TGF-β1、Smad3 蛋白表达水平较模型组明显降低。结果见图2、图3。TGF-β1、Smad3 蛋白表达水平计数通过平均光密度来表达，结果见表2。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 平均光密度表达 （±s）

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3 平均光密度表达 （±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05

组别 n TGF-β1 Smad3空白组 6 0.11±0.02 0.11±0.02模型组 6 0.3±0.031） 0.3±0.041）西药组 6 0.19±0.021）2） 0.18±0.011）2）中药低剂量组 6 0.27±0.021）2） 0.24±0.031）2）中药高剂量组 6 0.24±0.021）2） 0.22±0.031）2）中药联合西药组 6 0.14±0.011）2） 0.15±0.021）2）F 值 25.372 39.265 P 值 0.000 0.000

图2 各组大鼠支气管肺组织TGF-β1 蛋白的显色反应（免疫组织化学染色，10×40 倍）

图3 各组大鼠支气管肺组织Smad3 蛋白的显色反应（免疫组织化学染色，10×40 倍）

3 讨论

近年来随着生活节奏的加快、生活压力增大，人们身体素质减弱，更有外部大气环境污染程度增加，哮喘已成为发病率快速升高的疾病。哮喘作为一种发作性疾病，环境、压力、感染都能引诱其发作［9］，但就目前而言支气管哮喘发病机制仍不详尽。支气管哮喘患者受长期过敏原、炎症等刺激出现喘息、咳嗽、胸闷等症状，反复发作就会出现可逆性气流受限，随着病情进展，可致气道重构［10］。

2019 年最新的中国肺健康研究（CPH）结果显示，我国人群哮喘总体发病率4.2%，患者人数达45 700万［11］。虽然面对不同严重程度的哮喘，都有相应治疗药物，但患者仍然面临着病情的急性加重以及不可控的风险［12］。

气道重塑目前被认为是哮喘慢性化、持续化及严重化的病理基础，治疗哮喘必须与防治气道重塑相结合，才可能达到真正意义上的控制［13］。目前研究影响气道重塑的因素中，TGF-β/Smads 信号传导通路受到广泛关注。转化生长因子-β（TGF-β）是一种促纤维化细胞因子［14］，TGF-β 有3 种亚型，其中多个研究表明，TGF-β1能通过调节炎症因子的表达，促进成纤维细胞的分裂增殖、分化，促进成纤维细胞向肌纤维细胞转化［15-16］，而肌纤维细胞作为许多肺纤维化疾病中的效应细胞，最终使伤痕组织取代了正常肺实质，减少了气体交换表面，因而最终致使病人的呼吸能力下降［17］。由此可见，哮喘发作时，TGF-β1的表达程度、支气管平滑肌面积、支气管壁面积、嗜酸性细胞的数量均为正向表达。而Smads 作为发挥作用的下游重要效应蛋白，分为多种亚型，Smad3 为受体调节型蛋白，研究中其蛋白表达增加，由此可见Smad3 能够促进气道重塑。

中医学将支气管哮喘归属于“哮病”范畴，中医认为哮病的发生多是因宿痰伏于肺，因外感、饮食、情志、劳累等诱发，引动伏痰，壅塞气道，肺失宣降，致痰鸣如吼［18］。赵克明等［19］认为“少阳枢机失利”也是一个引起哮喘发作的重要因素。少阳作为气机升降之枢纽具有调畅气机的作用，治疗可以和解少阳、枢利气机为主。加味小柴胡汤是在小柴胡汤的基础上辅以麻黄、杏仁和紫苏子等降气平喘的药物。柴胡作为君药，黄芩作为臣药，一透邪一泄热，二者一升一降，构成和解少阳的基本理论结构。以人参、大枣益气健脾，意在扶正以祛邪，再佐以麻黄、杏仁和紫苏子等降气平喘之品，使药效更加显著。哮喘多由外因引动而发，故人体正气充盛，抵御外邪能力增强，卫外固密，邪无以入，则病不发。重视预防哮喘发作的重要性，素有哮喘的患者，可以通过增强自身正气，避免触发哮喘发作的诱因，保持平和的心态来预防哮喘发作，做到病未发而先防。

本研究结果表明，不论是减轻嗜酸性细胞的浸润，还是减缓促进气道重塑的TGF-β1、Smad3的表达，加味小柴胡汤都发挥其特有的作用。由此可见，加味小柴胡汤可以通过影响TGF-β1/Smad3 信号传导通路来减缓哮喘发作时引起的气道重塑。