壮药龙盘止咳方对急性气管-支气管炎幼鼠模型IL-4/IFN-γ 和基质金属蛋白酶的影响

邹 敏，韦 杏，农志飞，梅小平，甘 娜，宁碧彩，苏文静

（1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530200； 2.广西中医药大学，广西 南宁 530001；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

急性气管-支气管炎是一种儿童常见支气管黏膜炎症，气候变化或季节交替时易患此病，是肺炎的前期表现［1］。壮医作为传统医药的重要组成，文献中无此病名记载，根据其临床表现，与壮医文献中“勒爷奔唉”“埃病”相类似。壮医认为此病为外邪侵袭（主要由风邪为主），阻滞于气道，使气道不通畅或者脏腑功能失调，“咪钵”（肺）调节功能失职［2］。龙盘止咳方是一种挖掘于壮族民间的壮医复方，对急性气管-支气管炎的治疗积累了丰富的经验，但其作用机制尚不明确。研究表明，多种细胞因子和炎性介质参与了急性支气管炎的病理过程［3］，其中包括辅助性Th1/Th2 细胞因子或基质金属蛋白酶之间的失衡［4］。基于上述研究背景，本研究通过观察血清白介素-4（interleukin4，IL-4）和干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、肺金属基质蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）含量改变以探索壮医药防治儿童急性气管-支气管炎的药理学机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3～4 周龄Wistar 幼鼠60 只，购自广西中医药大学动物实验中心，体质量80～100 g。动物合格证：SYXK 桂2019-0001。Wistar 幼鼠饲养在本医院动物实验中心，控制温度（22±2）℃、湿度（80±5）%和12 h 光照/黑暗周期循环，可自由获取食物和水。所有动物实验均经过本医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器 大鼠IL-4 试剂盒（批号：EK0406）和IFN-γ（批号：EK0374）试剂盒为武汉博士德公司产品；TRIzol RNA 提取液（批号：15596018）为美国Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒、荧光定量检测试剂盒（批号：RR036A、RR096B）为日本Takara 公司产品；MMP9 和TIMP-1（批号：ab76003、ab211926）抗体为美国Abcam公司产品；RIPA 裂解液（批号：WB-0071）、ECL 化学发光试剂（批号：CSB-K11714CL）为北京鼎国生物公司产品。Synergy HT 型酶标仪为美国biotek公司产品，7500 型荧光定量PCR 仪为美国ABI公司产品，Gel Doc XR+型化学发光成像系统为新加坡Biorad 公司产品。

1.1.3 实验药物 壮药龙盘止咳方：本方由龙脷叶10 g，鱼腥草10 g，不出林5 g，柿叶5 g，盘龙参5 g 组成，制备成浓度为2 g 生药/mL 的混悬液。

1.2 实验方法

60 只Wistar 幼鼠随机分为对照组、急性气管-支气管炎模型组（模型组），低、中、高剂量壮药龙盘止咳方治疗组和阳性治疗组。对照组不做任何处理，模型组，壮药龙盘止咳方低、中、高剂量治疗组和阳性治疗组均制备急性气管-支气管炎模型。急性气管-支气管炎模型制备［4］：用烟叶及刨花各50 g 烟熏幼鼠，每天2 次，每次烟雾刺激30 min，共1 周。造模后壮药龙盘止咳方低、中、高剂量组分别给予龙盘止咳方10、20、30 mL/（kg·d）治疗1 周，阳性治疗组给予小儿宣肺止咳颗粒10 mL/（kg·d）治疗1 周。治疗1 周后腹腔注射10%水合氯醛麻醉幼鼠后，断头处死，采集幼鼠血清，打开胸腔，分离肺组织。

1.3 指标检测

1.3.1 ELISA 法检测血清IL-4 和IFN-γ 含量 收集幼鼠外周血，1500 r/min 离心15 min，收集血清-70 ℃保存。ELISA 操作步骤依照试剂盒说明书进行。

1.3.2 Real-time PCR 检测MMP-9 和TIMP-1 mRNA 含量 用TRIzol RNA 提取幼鼠肺组织总RNA，并逆转成cDNA，引物序列采用Primer 3.0 软件设计，由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。采用SYBR Green 法测定肺组织中MMP-9 和TIMP-1的相对mRNA 含量，具体步骤依照说明书进行。

表1 引物序列

1.3.3 蛋白免疫印迹检测MMP-9 和TIMP-1 蛋白含量 用RIPA 提取幼鼠肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后煮沸使蛋白变性，凝胶电泳分离总蛋白后并转移至PVDF 膜。封闭后一抗按1∶2000 相应稀释比孵育4 ℃过夜，二抗室温孵育后化学发光显色拍照，并利用灰度软件定量分析。

1.4 统计学方法

通过SPSS 19.0 软件进行统计学分析，采用均数±标准差（±s）表示计量资料，采用单因素方差分析进行多组间比较，两两比较用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组幼鼠一般情况和体质量变化情况比较

幼鼠在模型制备过程中逐渐出现扎堆眯眼、咳嗽流涕、呼吸急促、反应迟钝、食欲减退、毛发无光泽等表现。与对照组比较，模型组幼鼠体质量较轻（P＜0.05），经壮药龙盘止咳方或小儿宣肺止咳颗粒治疗后幼鼠体质量较模型组增加（P＜0.05），各治疗组之间幼鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1。

图1 各组幼鼠体质量变化情况

2.2 各组幼鼠血清IL-4 和IFN-γ 含量变化

与对照组比较，模型组幼鼠血清IL-4 升高，IFN-γ 降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组和阳性治疗组幼鼠血清IL-4 降低，IFN-γ 升高（P＜0.05）；与阳性治疗组比较，中、低剂量壮药龙盘止咳方组幼鼠血清IL-4 和IFN-γ 含量无明显变化（P＞0.05），高剂量组幼鼠血清IL-4 降低，IFN-γ 升高（P＜0.05）；随着壮药龙盘止咳方剂量的增加，幼鼠血清呈现IL-4 降低，IFN-γ 升高的趋势。结果见图2。

图2 各组血清IL-4 和IFN-γ 含量变化

2.3 各组幼鼠肺组织MMP-9 和TIMP-1 mRNA含量变化

与对照组比较，模型组幼鼠肺组织MMP-9 mRNA 含量升高，TIMP-1 mRNA 含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组和阳性治疗组幼鼠肺组织MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高（P＜0.05）；与阳性治疗组比较，中、低剂量壮药龙盘止咳方组幼鼠肺组织MMP-9和TIMP-1 mRNA 含量无明显变化（P＞0.05），高剂量组幼鼠肺组织MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高（P＜0.05）；随着壮药龙盘止咳方剂量的增加，幼鼠肺组织呈现MMP-9 mRNA 含量降低，TIMP-1 mRNA 含量升高的趋势。结果见图3。

图3 各组肺组织MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 表达变化

2.4 各组幼鼠肺组织MMP-9 和TIMP-1 蛋白含量变化

与对照组比较，模型组幼鼠肺组织MMP-9蛋白含量升高，TIMP-1 蛋白含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组和阳性治疗组幼鼠肺组织MMP-9 蛋白含量降低，TIMP-1 蛋白含量升高（P＜0.05）；与阳性治疗组比较，低剂量组幼鼠肺组织MMP-9 蛋白含量升高，高剂量组幼鼠肺组织TIMP-1 蛋白含量升高（P＜0.05）；随着壮药龙盘止咳方剂量的增加，幼鼠肺组织呈现MMP-9 蛋白含量降低，TIMP-1 蛋白含量升高的趋势（P＜0.05）。结果见图4。

图4 各组肺组织MMP9 和TIMP-1 蛋白表达变化

3 讨论

急性气管-支气管炎是儿童常见的呼吸道疾病，其主要临床表现为咳嗽、咯痰，常年均可发病，在气候变化、季节交替时更易发病。现代医学认为，受寒、过度疲劳或营养不良时，机体抵抗力下降，气管-支气管生理防御机能也减弱［5］，在各种因素的作用下，可诱发本病。

研究报道，IL-4/IFN-γ 在急性气管-支气管炎的病理生理学基础上发挥作用［6］，炎症反应过程存有辅助Th1/Th2 细胞因子之间的失衡。IL-4 和IFN-γ 分别是Th2 和Th1 分泌的两种互为拮抗作用的细胞因子［7］，IL-4 作为一种多种生物学活性的淋巴因子，能促进内皮细胞黏附分子表达，从而增强淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞与内皮细胞的结合而引起炎症细胞对局部组织浸润［8］，并对肺泡巨噬细胞具有趋化作用，使其产生花生四烯酸和超氧阴离子的能力增强，从而减轻炎症反应［9］。而IFN-γ 是目前作用机制比较明显的促炎细胞因子，是单核/巨噬细胞主要且强有力的激活因子，促进细胞介导的细胞毒反应［10］；IFN-γ 还可增强肿瘤坏死因子对血管内皮细胞的多种功能，研究表明，IFN-γ 的高表达加剧支气管炎的炎症反应［11］。基质金属蛋白酶在气道炎症的发生发展过程中也起到了重要作用，近年来认为MMPs/TIMPs 比例失衡与支气管炎的发生密切相关［12］。MMP-9 是MMPs 家族中的重要一员，在ECM 的降解、炎症反应及气道重构等多种生理病理过程中均扮演了重要角色。组织中MMP-9 的含量增加，可促进ECM 的降解速度，基底膜断裂，进而促进炎症细胞溢出扩散，聚集于呼吸道壁及呼吸道腔，加重其炎性反应［13］，从而促进肺部炎性疾病的发生发展。免疫复合物诱导MMP-9 基因缺陷小鼠，使其引起肺损伤，研究显示，基因缺陷组小鼠肺部受损严重度小于对照组，揭示了MMPs 在肺组织损伤中起到了重要作用［14］。TIMP-1 是MMP-9 特异性生理性抑制物，可以抑制MMP-9 的生物学效应，阻断MMP-9 与底物结合，从而减少对细胞外基质的降解。MMP-9/TIMP-1 比值的高低对呼吸道结构的稳定起决定性作用，MMP-9 和TIMP-1 的动态平衡目前被公认为是反应气道及肺组织破坏与修复的标志［15］。

本研究表明，急性气管-支气管炎幼鼠模型体质量减轻，IL-4 升高/IFN-γ 降低、MMP-9 升高和TIMP-1 降低（P＜0.05），表明模型制备成功，且利用小儿宣肺止咳颗粒治疗作为药物治疗的阳性组，明确药物治疗能够减低IL-4、升高IFN-γ，降低MMP-9 和升高TIMP-1 水平。

壮医认为此病为外邪侵袭（主要由风邪为主），阻滞于气道，使气道不畅，“咪钵”（肺）调节功能失职，临床以热证、实证多见。因为外邪侵袭常以风为先导，风为阳邪，化热最速，小儿又为纯阳之体，阳气偏盛，感邪更易化热，加上小儿先天肺脾虚弱，痰易滋生，若素有食积内热，或心肝火热，或外感热邪稽留，则可炼液成痰，痰热互结，阻于气道，肺失清肃发为痰热咳嗽［16］。壮医药治疗本病也有非常显著的疗效，但未见有相关的文献报道，这可能与壮医药的民族区域性有关，大多以口授身传的方式传授，影响了大家对壮医的了解。壮药治疗各种疾病已有数千年的历史，为广西人民的医疗卫生保障做出不可磨灭的贡献，所以一些民间壮医专家留下来的有效验方，值得我们进一步深入研究，填补壮医在此领域的空白。

本研究壮药龙盘止咳方挖掘于壮族民间，它结合广西环境气候湿热偏盛及小儿外感咳嗽以风热犯肺证为主的特点而选择用药，组成了具有“祛毒通气、化痰止咳”作用的壮药龙盘止咳方。本方由龙脷叶10 g，鱼腥草10 g，不出林5 g，柿叶5 g，盘龙参5 g 组成。方中龙脷叶通气道谷道、润肺止咳，主要用于埃病（咳嗽），胸闷；鱼腥草清热解毒、排脓消痈、利尿通淋，可用于肺痈吐脓，痰热咳喘；不出林通气道、清热毒、除湿毒，用于埃病（咳嗽），比耐来（咳痰）；柿子叶调气道、通龙路、止血，可用于埃病（咳嗽）；盘龙参通气道、清热毒、止咳化痰、消肿散结，主要用于埃病（咳嗽），阴虚内热。诸药合用奏“祛毒通气、化痰止咳”之功，即解毒祛邪，调气、通畅气道，使得天地人三气同步而达到治疗儿童急性气管-支气管炎的功效。

研究表明，不同剂量的壮药龙盘止咳方均能使得模型幼鼠体质量增加（P＜0.05），但与阳性治疗组幼鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。壮药龙盘止咳方也能减低IL-4、升高IFN-γ，降低MMP-9 和升高TIMP-1，随着壮药龙盘止咳方剂量的增加，幼鼠IL-4 和MMP-9 降低，IFN-γ 和TIMP-1 升高（P＜0.05）。而与阳性治疗组比较，中、低剂量的壮药龙盘止咳方治疗组幼鼠各项指标无明显变化（P＞0.05），高剂量组幼鼠IL-4 减低、IFN-γ升高，MMP-9 降低和TIMP-1 升高（P＜0.05）。表明壮药龙盘止咳方能够达到小儿宣肺止咳颗粒同样的治疗效果，且高剂量的龙盘止咳方能够更加显著地抑制急性气管-支气管炎幼鼠模型的炎症反应。

综上所述，本研究通过制备急性气管-支气管炎幼鼠模型，运用免疫学及分子生物学等现代技术对各组幼鼠干预后炎症反应指标进行测定与分析，客观评价壮药龙盘止咳方对急性气管-支气管炎幼鼠的干预效应。后续将进一步探讨壮药龙盘止咳方对急性气管-支气管炎的作用机制，为临床推广应用提供理论依据。