大豆异黄酮对坝上长尾鸡卵巢功能、生殖激素和肌肉品质的影响

官丽辉，马旭平，刘海斌，张立永*,关 琛，王志伟

(1.河北北方学院 动物科学技术学院，河北 张家口 075131；2.张家口市畜牧技术推广站，河北 张家口 075000；3.张家口市第七中学，河北 张家口，075000)

随着畜牧业的不断发展，抗生素的不良反应越来越凸显，寻找绿色安全且高效的饲料添加剂尤为重要。大豆异黄酮属于植物类雌激素，是大豆生长过程中形成的一种次生代谢产物,是一种生物活性物质，具有剂量小、见效快、不良反应小等优点，有提高蛋白质合成效率，改善胴体品质的优点，易被动物吸收利用，对动物生长性能、繁殖性能、抗氧化功能都有一定的影响，是一种新型的饲料添加剂[1]。蔡娟等[2]在海兰褐产蛋中期分别添加10，50，100 mg/kg大豆异黄酮，进行了12周的对比试验，发现产蛋率随着大豆异黄酮添加量的增加呈现出先提高后降低的趋势，而蛋白含量和蛋壳强度有了明显的提高。周玉传等[3]发现，给绍兴蛋鸭饲喂5 mg/kg的大豆异黄酮，结果绍兴蛋鸭的产蛋率有了很大的提高。蔡兴怀等[4]试验表明，在小鼠日粮中添加25，50，100 mg/kg的大豆异黄酮，均降低MDA在肝、肾中的含量，提高SOD、GSH-Px在肝、肾组织的活性。据报道，日粮中添加30 mg/kg大豆异黄酮，产蛋鸡ND的HI抗体滴度显著提高[5]。目前，大豆异黄酮作用于家禽卵巢功能和生殖激素的研究较少。

坝上长尾鸡是一种蛋、肉兼用型地方品种，通过长期的坝上生活环境饲养，具有很强的耐寒性、耐粗饲和抗病能力强、肉质鲜美等特点[6]。随着人们物质生活水平提高，对肉的品质问题越来越关注，消费者接受程度决定于肉质的优劣，而鸡肉作为重要的肉质来源之一，普遍被人们食用。但目前抗生素类、激素类的滥用，造成鸡体内化学物质残留，给畜牧业经济造成严重影响，更严重威胁着人类的健康，所以提高鸡肉品质是科研人员的主要目标。凭借独特的产品品质，坝上长尾鸡是唯一入选国家家禽志的河北地方鸡品种，极具竞争力，市场发展前景广阔。本试验以坝上长尾鸡为研究对象，研究大豆异黄酮对坝上长尾鸡卵巢功能、生殖激素和肌肉品质的影响，为新型饲料添加剂的开发利用以及地方优良品种的保护和繁育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂大豆异黄酮(4.7-二羟基异黄酮，>99.1%)，黄色粉末，南京松冠生物科技有限公司提供。

1.2 试验动物试验选取50周龄左右的健康状况良好的坝上长尾鸡150只，分为5组(Ⅰ～Ⅴ组)，每组3个重复，每个重复10只鸡。在基础日粮中分别添加5，10，15，20，25 mg/kg的大豆异黄酮。各试验鸡之间体质量量差异不显著。

1.3 试验日粮试验鸡日粮配制参照坝上长尾鸡饲养标准，配制成能量水平基本一致的试验日粮，日粮配方见表1。

表1 基础日粮配方及营养水平 %

1.4 试验动物的饲养管理试验期间自由采食和饮水，试验前对鸡舍以及鸡舍内所有设备进行清洗、消毒，试验开始后，鸡舍保持卫生清洁，其他饲养管理参照养殖场饲养管理模式。

1.5 测定的指标与方法

1.5.1卵巢功能的测定 宰杀坝上长尾鸡后摘取卵巢组织，把卵巢快速放到配制好的Davidson's AFA 固定液中，期间更换1次固定液。光镜下观察切片,分别用体视显微镜观察并记录各级卵泡数量。

1.5.2生殖激素指标的测定 选取健康且体质量基本一致的坝上长尾鸡，采用静脉采血法，采集1 mL 静脉血，2 500 r/min离心分离血清测相关激素指标。血清中LH、FSH 分泌量采用ELISA 法，血清中E2采用放射免疫法；PRL使用酶联免疫吸附法检测；P4使用放射免疫吸附法(RIA)。

1.5.3肌肉品质的测定 (1)肌肉物理性状：在试验最后1 d从每处理组选取2只鸡，采取口腔放血式屠宰，宰后45 min取胸肌，4℃冷冻保存24 h,利用相关仪器测物理性状指标，所测指标包括肉色、肌肉pH、肌肉系水力、剪切力。(2)肌肉组织学性状：试验结束时，在每个重复组抽取3只试验鸡，屠宰后摘取胸肌，冷冻保存，以待备用。用手术刀将其切片，制作厚度为 5 μm，进行常规HE染色，镜检，分别测量肌纤维直径和肌纤维密度，并计算其平均值。(3)肌肉风味物质：肌肉氨基酸测定采用高效液相色谱法。

1.6 数据统计分析采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 大豆异黄酮对坝上长尾鸡卵巢功能的影响见图1。正常初级卵泡、正常次级卵泡在Ⅲ组(15 mg/kg)最高，与低剂量Ⅰ组、Ⅱ组,高剂量Ⅳ组、Ⅴ组差异均不显著(P>0.05)；闭锁初级卵泡低剂量组与高剂量组之间差异显著(P<0.05)；闭锁次级卵泡Ⅲ组最低与Ⅳ组差异不显著(P>0.05)，与Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组差异均显著(P<0.05)，分别比Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅴ组降低2.51%,1.55%,1.35%；Ⅲ组的小黄卵泡和大白卵泡数量最高，分别比Ⅰ组高7.76% 和8.43%；Ⅲ组的小黄卵泡与低剂量Ⅰ组、Ⅱ组差异显著(P<0.05)，与Ⅳ组、Ⅴ组差异不显著(P>0.05)；Ⅲ组的大白卵泡数与Ⅰ组、Ⅴ组差异显著(P<0.05)，与Ⅱ组和Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。通过计算，15 mg/kg大豆异黄酮添加组(Ⅲ组)显著降低小黄卵泡、大白卵泡、各级卵泡的闭锁率(P<0.05)。卵巢功能各指标在数值上会随着大豆异黄酮添加量的升高表现出先上升后下降的过程。

图1 大豆异黄酮对坝上长尾鸡卵巢功能的影响

2.2 大豆异黄酮对坝上长尾鸡生殖激素的影响见图2。LH:Ⅲ组最高，与Ⅰ组、Ⅴ组差异显著(P<0.05)；与Ⅱ组、Ⅳ组差异不显著(P>0.05)，Ⅰ组、Ⅴ组之间差异显著(P<0.05)。FSH:Ⅲ组与高剂量Ⅳ组、Ⅴ组差异不显著(P>0.05)，与低剂量Ⅰ组、Ⅱ组差异显著(P<0.05)，分别比Ⅰ组高3.33%，比Ⅱ组高2.42%。E2:Ⅲ组最高，与Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组差异都不显著(P>0.05)，与Ⅰ组差异显著(P<0.05)，比Ⅰ组高3.19%；PRL:Ⅲ组最高，与高剂量组和低剂量组间差异都不显著(P>0.05)。P4:Ⅲ组最高，与Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组差异均显著(P<0.05)，与Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。

图2 大豆异黄酮对坝上长尾鸡生殖激素的影响

2.3 大豆异黄酮对肌肉物理性状的影响见图3。在日粮中添加不同剂量的大豆异黄酮后，Ⅲ组红度a*比Ⅰ组和Ⅴ组分别显著提高11.12%和9.08%(P<0.05)，Ⅱ组比Ⅰ组提高10.14%；亮度L*和黄度b*各试验组之间差异均不显著(P>0.05)，变化无规律性；肌肉pH:Ⅲ组显著低于Ⅰ组和Ⅱ组，分别降低3.81%和2.14%(P<0.05)；剪切力:Ⅲ组显著低于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组(P<0.05)。肌肉系水力:Ⅲ组显著高于Ⅰ组11.9%(P<0.05)，但Ⅲ组与Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4 大豆异黄酮对肌肉组织学性状的影响由表2可看出，在日粮中添加大豆异黄酮后，坝上长尾鸡胸肌肌纤维直径各试验组之间差异不显著(P>0.05)；肌纤维密度Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组极显著高于Ⅴ组(P<0.01)，Ⅱ组与Ⅲ组显著高于Ⅰ组、Ⅳ组和Ⅴ组(P<0.05),Ⅳ组和Ⅴ组之间差异不显著(P>0.05)，Ⅲ组比Ⅳ组、Ⅴ组分别提高29.20%和36.23%。即添加15 mg/kg的大豆异黄酮后对肌肉的组织学性状效果最佳。

图3 大豆异黄酮对肌肉物理性状的影响

表2 大豆异黄酮对肌肉组织学性状的影响

2.5 大豆异黄酮对肌肉风味物质的影响从表3可看出，在日粮中添加大豆异黄酮后，必需氨基酸各试组间差异均不显著(P>0.05)，也无规律性影响；天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸在各组间差异不显著(P>0.05)，但呈现先升高后降低的规律，且Ⅲ组较高。

表3 大豆异黄酮对肌肉风味物质的影响 %

3 讨论

3.1 大豆异黄酮对坝上长尾鸡卵巢功能的影响卵巢和输卵管构成雌禽的生殖系统，卵泡的发育与产蛋性能关系密切[7]，卵巢的健康与否决定着蛋鸡繁殖性能的高低，而各级卵泡的闭锁率以及生殖激素的分泌量又是衡量卵巢是否健康的重要指标。顾欢等[8]试验证明，给伊莎蛋鸡饲喂10 mg/kg大豆异黄酮，试验数周后产蛋率得到了明显的提高，卵泡闭锁率明显下降从而促使了卵泡的发育。周轶琳等[9]在母鸡基础饲粮中分别添加10 mg/kg和15 mg/kg 大豆异黄酮，试验28 d，10 mg/kg 大豆异黄酮添加组对各级卵泡的闭锁率影响不显著(P>0.05)，而15 mg /kg 大豆异黄酮添加组显著提高了各级卵泡数量(P<0.05)。曹满湖等[10]研究表明，大豆异黄酮能显著提高产蛋后期蛋鸡的初级卵泡数量，添加量为15 mg/kg 时极显著降低小黄卵泡、大白卵泡、次级卵泡的闭锁率，添加量为10 mg/kg 时对各级卵泡的闭锁率影响不显著。在本试验中，正常初级卵泡和正常次级卵泡的数量在各组间没有显著性差异，但中剂量组较高；小黄卵泡和大白卵泡数量也大大增加，各级卵泡的闭锁率显著下降(P<0.05)，这可能是适当剂量大豆异黄酮具有雌激素受体激动剂的功能，促使了雌激素和促性腺激素受体mRNA的分泌量增加，从而提高了产蛋率改善了卵泡的发育[11-12]。试验中卵巢功能各指标在数值上会随着大豆异黄酮添加量的升高表现出先上升后下降的过程。可能是因为大豆异黄酮影响畜禽的繁殖性能的关键是利用其内源性雌激素水平，过高剂量的大豆异黄酮会与雌激素竞争雌激素受体，起抗雌激素的作用，对坝上长尾鸡的卵巢和输卵管等繁殖器官发育的影响是拮抗而不是促进，该试验结果建议大豆异黄酮在蛋鸡饲料中的添加是有安全限量的。

3.2 大豆异黄酮对坝上长尾鸡生殖激素的影响家禽生殖激素的分泌与其生殖机能息息相关，在家禽繁殖过程中，不同的生殖激素会使机体呈现不同的生殖反应，家禽不同的生理阶段生殖激素也会呈现出不同形态而各种生殖激素构成了支配生殖机能的内分泌体系，影响整个生殖过程。研究表明，LH对膜细胞的刺激会影响到睾酮和雌二醇的合成，从而影响到卵泡的发育和卵巢的成熟，而FSH作为调控卵泡的主导激素，也影响卵泡发育。E2作为禽类主要的雌性激素，能促进肠道吸收，使血中钙、磷和蛋白质提高，同时刺激输卵管生长。血清中的P4具有双向调节作用，低浓度的P4具有促排卵作用，PRL直接作用于卵巢从而抑制卵泡的发育使禽类出现就巢的现象。周振雷等[13]利用大豆异黄酮对蛋鸡生殖激素的影响进行了试验，结果显示LH、FSH随着大豆异黄酮剂量的增加也呈现上升的趋势，但各组之间差异不显著(P>0.05)。于尚誉等[14]认为，把5，10，15 mg/kg大豆异黄酮添加在种用鸡日粮中，LH分泌量得到了明显的增加而且呈不断上升的趋势。郭晓红等[15]研究证明，添加大豆异黄酮5～15 mg/kg，鸡体内FSH水平有所上升，添加量为5 mg/kg时，明显有促进作用。彭曼丽等[16]试验证明，在北京鸭开产前饲粮中加入大豆异黄酮，观察E2的变化规律，发现开产前13～18 d血浆中E2有上升趋势，于开产前8 d达到高峰。姜礼文等[17]研究表明，随着大豆异黄酮添加剂量的不断增加，蛋鸡血清中P4含量呈现不断降低的趋势，但各组之间差异均不显著(P>0.05)。本试验结果表明，适宜剂量的大豆异黄酮对坝上长尾鸡的生殖激素有较好地提高作用，但其对动物各级卵泡的作用尚不明确，可能是家禽性腺类固醇的受体主要存在于垂体和下丘脑，而大豆异黄酮又具有雌激素作用，可以同时对垂体和下丘脑进行调节，所以使促性腺激素水平有了明显的改变，从而影响了促性腺激素基因的表达与合成，促进卵巢雌激素受体(ER)、促卵泡素受体(FSHR)基因的表达，从而提高动物的繁殖性能。但过高剂量大豆异黄酮使生殖激素下降可能与其植物雌激素的作用效应有关，不同生理状态下产生的作用不同，大豆异黄酮与机体内源性雌激素争夺体内雌激素受体，鸡体内雌激素水平升高，干扰下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌轴，抑制下丘脑的促性腺激素释放激素，减少生殖激素的合成和分泌，造成畜禽的生殖能力下降[18]。

3.3 大豆异黄酮对坝上长尾鸡肌肉物理性状的影响坝上长尾鸡是高寒草原柴鸡品种，长期的自然选择使其耐寒力和抗病力增强，肌肉品质鲜美独特。肉色是肌肉外观评定的决定因素之一，肌肉颜色深浅与肌红蛋白和血红素铁的氧化程度有关,多用黄度、亮度、红度等3种指标测定，肉的褪色与肉中氧化过程速率有关。pH值在一定范围内越低表示肌肉嫩度越好。系水力的大小是指肌肉组织保持原有水分能力的高低，它影响肉色、风味和嫩度。ALLEN等[19]认为通过系水力、滴水损失对肌肉系水能力进行评价，并且滴水损失与系水力呈负相关，滴水损失越小、系水力越大，肉质越好。剪切力作为决定肉质嫩度的主要因素，是人们对肌肉口感接受程度的指标之一。JIANG等[20]试验得出，在基础日粮中添加40 mg/kg的大豆异黄酮略微提高了鸡肉系水力，添加 20，40 mg/kg大豆异黄酮对鸡肉的 pH 值有显著影响，使鸡肉品质得到改善。PAYNE等[21]研究表明，在基础日粮中添加大豆异黄酮，Cornish X Plymouth Rock雄性肉鸡的胸肌质量与腹脂的质量呈负相关，净肉率增加。

因此,肉品质特性和肌肉系统的氧化反应链紧密相关,大豆异黄酮有雌激素受体活性，对鸡体有较好地抗氧化作用，使抗氧化因子和促氧因子之间保持相对平衡。这在本课题组所做的大豆异黄酮对坝上长尾鸡抗氧化功能的影响试验也验证了这一点，适宜的大豆异黄酮能阻止肌肉中Fe2+氧化成Fe3+,理想剂量能够保护胸肌肉色的稳定性，在一定剂量下大豆异黄酮系水力能更好保护肌肉细胞膜,防止水分损失，使鸡肉的剪切力处于较低值，肉质更嫩。

3.4 大豆异黄酮对坝上长尾鸡肌肉组织学性状的影响肌肉的基本单位由肌纤维组成，肌肉的嫩度主要是由肌纤维存在的状态所决定的，嫩度通常用肌纤维密度和直径2个指标去评定。目前，很多试验得出大豆异黄酮利于肌肉生长，通过降低肌纤维直径、提高肌肉嫩度，从而改善肌肉品质。刘兆斌[22]把大豆黄酮连续灌服于大鼠，结果发现50 mg/kg大豆黄酮组脂肪细胞直径大小下降8.78%(P>0.05),脂肪细胞密度上升5.45%(P>0.05)；王玉艳等[23]研究结果显示，3 mg/kg大豆黄酮与50 mg/kg 半胱胺产生协同作用之后，发现肌纤维直径变小，明显改善肉质。

本试验结果表明，适宜的大豆异黄酮能更好促进肌肉生长，显著提高肌纤维密度，使肉质更为细嫩。其作用机理可能是大豆异黄酮含有异黄酮类植物雌激素，与体内的雌激素竞争下丘脑与垂体上的雌激素受体，适宜剂量的大豆异黄酮可发挥雌激素的效应，刺激生长、生殖系统，促进体内相关的生长激素如睾酮、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)的产生和释放，促进蛋白质的消化、吸收，促使肌纤维肥大，增大肌纤维的直径与密度，进而改善肌肉的嫩度和鲜度；这与本试验所测的大豆异黄酮对肌肉的物理性状的结果相一致。

3.5 大豆异黄酮对坝上长尾鸡肌肉风味物质的影响坝上长尾鸡是极具地方特色的优良鸡品种，鸡肉营养价值高。肉的风味包括香味和滋味，主要由脂质过氧化和蛋白水解产生的氨基酸、肽类决定[24]。肌肉中总游离氨基酸组分是衡量其营养价值的重要指标之一，一般认为，随着必需氨基酸含量的增加营养价值也随之提高，同样甜鲜味氨基酸含量高的肉质风味更佳。本课题组进行的大豆异黄酮对坝上长尾鸡抗氧化的试验结果也表明，添加大豆异黄酮显著提高了试鸡血浆中GHS-Px、T-SOD和 CAT活性,这些结果表明大豆异黄酮能通过提高抗氧化酶活性加快脂肪酸的氧化，转化能量为ATP，分解产生大量的肌苷酸，而肌苷酸具有风味特性，是鸡肉质鲜味特性的主要物质基础，所以大豆异黄酮可防止风味物质的流失，对鸡肉起到了一定的保鲜作用。本试验结果表明，大豆异黄酮在促进试验鸡氨基酸增长方面作用不明显，证明该剂量大豆异黄酮的添加对坝上长尾鸡风味特性指标作用不明显。

综上所述，从卵泡数目、激素各指标及肌肉品质来看，在饲料中添加大豆异黄酮能显著提高坝上长尾鸡的繁殖性能及肌肉品质，对地方特色品种的开发利用具有深远的意义。