内皮祖细胞在肺动脉高压中的研究进展*

李晋秋， 舒 婷， 王 婧

（中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京100730）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是指在海平面静息状态下平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥20 mmHg，肺血管阻力（pul⁃monary vascular resistance，PVR）≥3 Wood units 的一种疾病或病理生理综合征［1］。PH的病理特征主要是肺小血管结构和血管壁细胞功能变化导致的肺血管重塑，从而引起肺血管阻力增加，进而导致右心功能下降乃至右心衰竭，最后患者死亡［2］。内皮细胞（en⁃dothelial cells，ECs）功能失调是导致血管重塑的重要原因［3-4］。ECs 的功能受多种调控因子影响，其增殖、迁移和血管形成能力的改变会导致管腔狭窄、阻塞或小血管丢失［5-6］。个体出生后ECs可由内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分 化 而 来，EPCs 作为ECs 的前体细胞，在血管生成中发挥重要作用［7-9］。EPCs 的发现改变了人们对出生后血管生成过程的认识，EPCs 在各类血管疾病发生发展中的研究越来越多，为相关治疗提供了新的可能。目前EPCs 与PH 的研究焦点在于循环EPCs 的移植治疗，但是对循环EPCs 在PH 中的作用机制以及组织驻留EPCs在PH中的作用研究较少。本文就各类EPCs的生物学特性、在PH 中的作用以及临床应用的研究进展进行综述。

1 EPCs的生物学特性

EPCs 最初于1997 年由Asahara 等［10］根据细胞表面抗原CD34 和血管内皮生长因子（vascular endothe⁃lial growth factor，VEGF）的受体Flk-1 的表达，利用磁珠从人外周血中分离得到；在体外实验中证实分离的EPCs 可以分化为ECs；在家兔缺血模型中观察到，EPCs 在体内可以结合到血管生成活跃位点，促进血管生成。外周血中的循环EPCs（circulating EPCs）起源于骨髓，可以迁移到受损的血管处参与血管修复和出生后的血管新生［9］。后来陆续观察到在血管壁和肺组织中存在组织驻留EPCs（resident EPCs），参与组织损伤修复［11-12］。

1.1 早期EPCs 将外周血或骨髓经过梯度离心分离出单核细胞层，再将单核细胞进行培养，从中分离出循环EPCs［13］。根据分离培养时间的长短可将其分为两类：早期EPCs（early EPCs）和晚期EPCs（late EPCs）。早期EPCs 是体外培养4～7 d 分离出的纺锤形细胞，表达谱接近于造血系干细胞（CD14+/CD45+，CD31+/VE-cadherin-/CD34-）［14-15］，因此也有人将其称为造血系EPCs（图1）。循环血管生成细胞（circu⁃lating angiogenic cells，CACs）、髓系血管生成细胞（myeloid angiogenic cells，MACs）和促血管生成造血细胞（pro-angiogenic hematopoietic cells，PACs）等都是早期EPCs。

在功能上，早期EPCs 的增殖潜能低，在体外培养过程中形成集落或小管的能力弱，但是可以通过旁分泌作用减轻血管损伤，保护正常内皮细胞［14，16］，且旁分泌作用不受缺氧的影响［17］。早期EPCs 分泌的可溶性因子通过调节细胞内抗氧化防御机制和促生存信号，预防氧化应激造成的成熟ECs 凋亡［16］。除了对ECs 的调节，早期EPCs 分泌的降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）还可以抑制血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）诱导的血管平滑肌细胞增殖［18］。

1.2 晚期EPCs 晚期EPCs 是体外培养超过1 周分离出的鹅卵石样细胞，表达谱相较于早期EPCs 更接近于内皮细胞（CD14-/CD45-，CD31+/VE-cadherin+/CD34+）［14-15］，因此与早期EPCs 被称为造血系EPCs 相对应，晚期EPCs也被称为非造血系EPCs（图1）。由于晚期EPCs 具有较强的集落形成能力，因而也被称为内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells，ECFCs）。根据ECFCs 中的醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）表达量，还可将其分为高表达ALDH 的ECFCs 和低表达ALDH 的ECFCs，且低表达ALDH的ECFCs具有更强的迁移和增殖能力［19］。

除了使用干细胞标志物（如c-Kit、CD34 等）和ECs标志物［如CD31、激酶插入结构域受体（kinase in⁃sert domain receptor，KDR）等］，FITC-UEA-I 和DiIAc-LDL也可以用于鉴定分离出的EPCs［20］。不同研究定义早期EPCs 和晚期EPCs 所使用的标志物各有不同（表1）［15，21-28］，给相关研究带来了一定程度的阻碍。

Figure 1. Origin and classification of endothelial progenitor cells（EPCs）. EPCs can be divided into two catego⁃ries：circulating EPCs and resident EPCs. Resident EPCs exist in tissues at birth. Circulating EPCs are derived from bone marrow and can be isolated from monocytes in vitro. The spindle-shaped early EPCs which retain the markers CD14 and CD45 of hemato⁃poietic cells are isolated after being cultured for 4～7 d. The cobblestone-like cells isolated after in vitro culture for ＞1 week are called late EPCs. Late EPCs are CD14/CD45- cells with the potential to differen⁃tiate into ECs and participate in the repair of blood vessels. CACs：circulating angiogenic cells；MACs：myeloid angiogenic cells；PACs：pro-angiogenic he⁃matopoietic cells；ECFCs：endothelial colony-forming cells.图1 EPCs的来源及分类

晚期EPCs 的体外增殖和血管形成能力强于早期EPCs，体内移植实验也表明晚期EPCs更能增强缺血性腿部的毛细血管侧支形成［15］。除了可以直接分化形成ECs 修复损伤血管，晚期EPCs 也可以通过外泌体发挥功能。晚期EPCs 外泌体中的促血管生成因子内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、血 管 生 成 素1（angiopoietin-1，ANG-1）等含量增加，有利于内皮新生，促进血管损伤修复［29］。此外，晚期EPCs 还可以通过外泌体刺激心脏成纤维细胞增殖和间充质-内皮转化，促进血管形成［30-31］。早期和晚期EPCs在生物学特性上的差异使得它们在疾病发生发展和治疗中发挥了不同的作用。

表1 早期EPCs和晚期EPCs标志物的比较Table 1. Comparison of the markers of early EPCs and late EPCs

1.3 组织驻留EPCs EPCs 不仅存在于外周循环中，Schniedermann 等［32］的研究检测到在小鼠肺微循环中存在具有高增殖潜能、CD133 表达阳性的组织驻留EPCs。然而，组织驻留EPCs 的定位、鉴别及其功能尚未明确。如何鉴别循环EPCs 和组织驻留EPCs 是当前研究EPCs 面临的一个问题。有研究利用GFP 小鼠骨髓移植对骨髓源性的循环EPCs 进行示踪以排除循环EPCs 参与低氧诱导的肺血管损伤修复，但是没有直接证明组织驻留EPCs 在此过程中的作用［33］。近期Iba 等［34］的研究显示脂肪组织驻留EPCs 是非骨髓来源的，并且高表达CD157。此前也有研究报道CD157可以作为小鼠器官大动脉和静脉组织驻留血管内皮干细胞的标志物［35］。因此，CD157 或许可以作为区分组织驻留EPCs 和循环EPCs的分子标志物之一。

2 EPCs与PH的发生发展

2.1 PH 中循环EPCs 的变化 作为一种骨髓源性细胞，当血管损伤时，循环EPCs 从骨髓中被动员起来，募集到血管损伤处，以替代功能失调的ECs，恢复缺血组织的血液灌注。但是在PH 发生发展过程中骨髓源性循环EPCs 的变化及其作用仍然存在争议。到目前为止，对PH 患者循环EPCs 水平的评估结果依然是矛盾的。有研究显示，在合并动脉型肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）的先天性心脏病（congenital cardiac disease，CHD）患儿中，循环EPCs 的数量是没有PAH 的CHD 患儿的1/2，且EPCs水平与患儿mPAP呈负相关［36］。在成人PAH患者和COPD 合并PH 患者中也有循环EPCs 数量减少的 报 道［37-38］。并 且，在 野 百 合 碱（monocrotaline，MCT）诱导的大鼠PH 模型中，循环EPCs 数目也降低［39］。然而，也有研究提供了截然不同的结果，认为PAH 患者肺部丛状损伤中的EPCs 数量和循环EPCs数量均升高［40-41］，而慢性血栓栓塞性肺动脉高压（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，

CTEPH）患者循环EPCs数量则无明显变化［37］。EPCs数量变化不一致可能是因为使用不同的标志物鉴定、EPCs 类型不同或PH 类型、分期不同等，但是导致这一矛盾结果的真正原因还需要进一步探索。

除了数量变化评估结果矛盾，在PH 发生时循环EPCs 是否能被募集到受损肺部的报道也是不一致的。有的研究认为循环EPCs 并不能被募集到损伤的肺部替代损伤的肺小血管，或者被募集的数量有限［24，42］。而Harper 等［43］在MCT 诱导的PH 大鼠中移植EPCs 后，观察到移植的EPCs 主要被募集到肺部，在循环中仅少量存在，但是这些聚集到肺部的EPCs大多在24 h内丢失。Pan等［44］的研究甚至表明，移植到MCT 大鼠模型中的EPCs 不仅可以定植于肺血管内皮，还能在肺血管内皮中持续存在超过1 周。因此，还需要更多的研究明确循环EPCs 是否能在PH发生时被募集到损伤的肺部参与血管修复，并且需要探明被募集的EPCs丢失的原因。

2.2 循环EPCs 对PH 的作用 目前对于循环EPCs在PH 中的作用持有两种观点。一种观点认为循环EPCs 在PH 中起保护作用。针对PAH 的治疗可以使PAH 患者下降的循环EPCs 数量有所回升［37］。可溶性鸟苷酸环化酶激动剂Riociguat 可以通过上调CTEPH 患者循环EPCs 的数量及循环EPCs 中VEGFC等血管生成相关因子的基因表达，使肺微血管内皮细胞的血管生成能力增强［27］。另一种观点认为，循环EPCs 的功能失调是导致PH 的原因之一。特发性PAH（idiopathic PAH，IPAH）的MACs 凋亡增加，受血管内皮生长因子诱导的迁移能力降低［45］。MCT 诱导的PAH 大鼠循环EPCs 的Ca2+通道受到抑制［46］，将PAH 小鼠的骨髓移植到健康小鼠中，可以诱使健康小鼠发生PH［47］。此外，低氧使循环EPCs 的NADPH氧化酶/血管过氧化物酶1 通路信号上调，促使循环EPCs 发生氧化损伤和功能失调，从而导致PH 的内皮功能失调［48］。循环EPCs 移植到大鼠体内，在低氧条件下定植到肺泡毛细血管以及肺动脉中，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2 和BMP 受体2（BMP receptor 2，BMPR2）的表达增加，EPCs 开始不受抑制地增殖，进一步堵塞血管，从而促进了低氧诱导的大鼠PH的发生［41］。

2.3 组织驻留EPCs 对PH 的作用 组织驻留EPCs也在PH 的发生发展中发挥了一定作用。Nishimura等［33］的研究显示，当小鼠暴露于低氧状态下时，肺血管 内 皮 细 胞（pulmonary vascular endothelial cells，PVECs）的数量减少。低氧处理1 周后，有增殖活性的PVECs 增加，尤其是毛细血管处的PVECs，并且伴随PVECs 表面的CD34 表达增加。而小鼠骨髓移植实验显示，低氧条件下骨髓来源细胞在肺内的定植较少，表明低氧条件下增殖增加的PVECs 来源可能是肺组织中的驻留EPCs 而非循环EPCs。该研究团队同时也观察到，在脂多糖诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠模型中，肺血管损伤后PVECs增殖增加，增殖 的PVECs 表 面CD34、Flk-1/KDR 和c-Kit 表 达 较强，而Prom-1/CD133表达较弱，且骨髓移植实验表明增殖的PVECs 主要来源于组织驻留EPCs［12］。目前关于组织驻留EPCs 的报道较少，这些研究提示或许在PH 的肺血管损伤修复过程中组织驻留EPCs 也发挥了作用，但是仍然缺乏这方面的直接证据。

3 EPCs与PH的治疗

骨髓源性细胞在PH 时可迁移至肺部形成成纤维细胞、ECs和平滑肌细胞等多种细胞［49］。健康小鼠移植BMPR2-/-小鼠骨髓会上调肺微血管周围的炎性细胞数量，促进血管肌化，进而促进PH 的发生；而给BMPR2-/-小鼠移植健康小鼠的骨髓可以治疗PH［50］。将对PH 易感的BMPR2+/-小鼠的骨髓移植到野生型小鼠体内会因增加其对脂多糖诱导PH 的敏感性而发生PH；而将野生型小鼠的骨髓移植给BMPR2+/-小鼠则可以防止PH 的发生［51］。这些研究提示了骨髓源性细胞与PH 的发生相关，骨髓移植为PH 治疗提供了新的思路。然而，骨髓源性细胞种类众多，在骨髓移植治疗PH 过程中发挥主要作用的细胞类型尚不清楚。循环EPCs 作为一种骨髓来源的具有一定干细胞特性的细胞，在PH 治疗中具有一定的应用前景。目前关于循环EPCs 治疗的研究多集中在体循环血管疾病领域，循环EPCs 移植治疗PH 的基础研究和临床研究较少，并且治疗效果存在争议。此外，近期的回顾性研究发现，在接受过骨髓移植治疗的患儿中，PH是发病率被低估且致死率高的严重并发症之一［28］。因此，需要谨慎评估骨髓移植或循环EPCs移植治疗PH的可行性。

3.1 EPCs 移植治疗PH 的动物实验 现有的研究表明，移植早期EPCs 对PH 的治疗没有明显的作用：移植CACs 对MCT 诱导的大鼠PAH 无治疗作用［52］；骨髓源性PACs 反而会通过5-羟色胺2B 受体信号加重PH 和肺血管硬化［53］。因此，多数EPCs 移植治疗实验使用的是晚期EPCs。

早期的研究表明，移植从大鼠骨髓中分离的EPCs 可以预防MCT 诱导的PAH，阻止右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）升高，维持肺毛细血管的连续性和微血管结构，提示在肺损伤早期，循环EPCs 有助于维持肺微血管的结构，防止肺微血管损伤，预防PAH 的发生［54］。循环EPCs移植还可以阻止MCT 诱导的PAH 继续进展［54］，降低PAH大鼠RVSP，减轻右心肥厚情况［55］。近期研究也显示，CTEPH 猪模型移植循环EPCs 也可以改善右心室功能，增加心室毛细血管密度［56］。尽管这些研究提示了循环EPCs 移植在PAH 治疗中具有积极的作用，但是Ikutomi 等［24］的研究表明，不论是移植早期EPCs还是晚期EPCs，EPCs都不能被募集到肺部，替代损伤的肺小动脉内皮，减轻MCT 诱导的大鼠肺损伤。细胞质膜陷窝蛋白1（caveolin-1，CAV-1）敲除小鼠会患上类似PH 的心肺疾病，给CAV-1 敲除小鼠移植健康的骨髓，仅有RVSP 升高和右心肥大受到抑制，而肺血管内皮的重塑不受影响［57］。这些研究对于移植晚期EPC 治疗PH 肺血管损伤的效果存在分歧，但是一般认为循环EPCs 移植对PH 右心肥厚和RVSP 升高等右心症状有所缓解。需要明确的是，循环EPCs 是否直接定植到并且取代受损的肺血管内皮与循环EPCs 能否促进血管修复并不矛盾，因为EPCs 可以通过旁分泌作用影响血管生成，但前提是其能够被募集到肺组织。

除了直接移植循环EPCs，还有研究将分离出的循环EPCs 经过质粒转染修饰后进行移植，实验结果显示治疗效果优于直接移植EPCs。体外分离EPCs后转染eNOS 质粒构建eNOS-EPCs，移植eNOS-EPCs比移植EPCs 更能使血流动力学改变导致的PAH（hemodynamic PAH）大鼠模型的肺动脉肌化程度和肌层厚度明显降低，甚至恢复正常［58］。在MCT 诱导的大鼠PH 模型中，Song［39］检测到循环EPCs 数目和血浆前列环素浓度降低，且二者存在正相关，而构建和移植环氧合酶1-前列环素合酶-EPCs，比单纯移植EPCs 更能降低MCT 大鼠的RVSP，抑制右心室肥厚和肺血管壁增厚［59］。CD40 通路参与了血管炎症的发生，MCT 处理后的大鼠血清可溶性CD40 配体（soluble CD40 ligand，sCD40L）水平升高，sCD40L 可以损害EPCs 的迁移、黏附、增殖和血管生成功能，因此，移植转染了CD40 shRNA 的EPCs 可以更好地改善MCT 大鼠的血流动力学并逆转血管重构［44］。此外，将转染了人缺氧诱导因子1α 的EPCs 移植到采用颈总动脉和颈静脉吻合术建立的PAH家兔模型体内2 周后，家兔mPAP 降低，右心室肥厚和肺血管重构被逆转，肺小动脉数目增加［60］。由此可见，将循环EPCs 进行基因修饰后再移植不失为一种优化EPCs移植治疗的方案。此外，Xu 等［61］的研究还表明，敲除E2F 转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）可以通过降低丙酮酸脱氢酶激酶2 和4 来增加EPCs的氧化代谢，降低乳酸生成，从而促进EPCs 向ECs分化，因此抑制E2F1 也对EPCs 移植治疗具有积极作用。

3.2 EPCs 移植治疗PH 的临床试验 EPCs 移植治疗PH 的临床试验使用患者自体外周血来源的EPCs（peripheral blood-derived EPCs，PB-EPCs）。目前一些相关的临床试验已完成，尚有研究正在进行（表2），但是关于EPCs 移植治疗PH 成功的临床试验报道很少。2007 年浙江大学首次报道了自体PB-EPCs移植治疗PH 的临床研究结果［62］。该研究纳入了31名成年IPAH 患者，抽取患者外周血进行体外培养，分离出PB-EPCs 并扩增，再将患者的自体PB-EPCs通过静脉输注回患者体内，12 周后评估治疗效果。患者对自体PB-EPCs 移植治疗表现出良好的耐受性，且与常规治疗的患者相比，6 min 步行距离（6-min walk distance，6MWD）、mPAP、PVR 和心输出量（cardiac output，CO）都有所改善［62］。2008 年该研究团队再次报道了在13 名儿童PAH 患者中进行自体PB-EPCs 移植的临床试验，得到了同样的结果［63］。此后，加拿大、墨西哥等国先后在www.clinicaltrials.gov网站注册并开展了3项评估EPCs移植治疗PH的有效性及安全性的临床试验（表2）。Granton 等［64］将7 名患者自体PB-EPCs 经体外分离、培养并转染eNOS 质粒后，重新经肺动脉导管输送回患者体内，患者耐受性良好，短期内没有血流动力学恶化的证据，并且在接受治疗后6MWD 明显增加，但是有1 例严重终末期患者出院后立即死亡。

表2 www.clinicaltrials.gov网站注册的EPCs治疗PH临床试验Table 2. Registered clinical trials of treating PH with EPCs on www.clinicaltrials.gov

现有已公布结果的临床试验结果表明，多数PH患者对自体PB-EPCs 移植治疗耐受性良好，且能改善患者的mPAP、PVR、CO 等相关指标。然而，这些临床研究都是短期的（12～24 周），EPCs 移植治疗是否长期有效并不清楚。不同的研究纳入的患者年龄和性别组成以及PH 临床分级不同，对患者EPCs 的分离培养时间和鉴定所用的标志物不同，在此过程中造成的差异使得EPCs 移植治疗的有效性和安全性无法得到统一的评估。此外，对EPCs 的临床前研究尚不透彻，今后需要更多的动物实验和临床前瞻性研究为临床试验提供依据。

4 展望

EPCs 作为ECs 的前体细胞，在个体出生后的血管生成和损伤血管修复过程中发挥了重要的作用。因此，有大量的研究探索了EPCs 在心血管疾病中的作用及其在临床治疗中的应用前景。但是，EPCs在PH 发生发展中的基础研究和EPCs 移植治疗PH 的临床研究尚不完善，还面临着诸多问题。

首先，EPCs 本身的定义和鉴别标志物尚无统一的标准。什么样的细胞可以被认为是EPCs，如何鉴别循环EPCs 和组织驻留EPCs 等问题亟待解决。其次，循环EPCs 是否能在PH 发生时被募集到受损的肺部参与血管修复以及循环EPCs 移植治疗的效果如何都没有定论。明确EPCs 的分类和移植方法或许有助于分析结果产生差异的原因。此外，组织驻留EPCs 对PH 发生发展影响的研究还在起步阶段，机制研究欠缺，并且循环EPCs 和组织驻留EPCs 对PH 的影响是协同作用还是某一方占主导地位尚不明确。对组织驻留EPCs 的定位、鉴别以及功能的研究可以为PH 发病机制的探究和治疗提供新思路。EPCs 在PH 治疗中的应用前景是公认的，但是针对EPCs 与PH 的基础研究还有很大的完善空间，需要更多的证据支撑临床应用研究的开展。