菟丝子黄酮通过调控ZBED3-AS1影响成骨细胞凋亡*

孙奇华， 蔡红慧， 何爱玉， 祝炳军

（绍兴文理学院附属医院中西医结合科，浙江绍兴312000）

骨质疏松是一种常见的代谢性骨病变，表现为骨量减少，骨微结构破坏、骨脆性和骨折风险增加［1］。成骨细胞是骨重建中的关键细胞，其活力减弱和功能降低可导致骨形成和骨吸收之间失衡，最终导致骨质疏松发生［2］。因此，如何有效的提高成骨细胞活力，对于防治骨质疏松症具有重要意义。菟丝子别名黄丝、黄藤子和豆寄生，是双子叶植物旋花科植物菟丝子的干燥种子，《中国药典》等典籍对其药理作用均有记载。菟丝子黄酮（total flavones from Cuscuta chinensis，TFCC）是菟丝子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、补肾益精、养肝明目和免疫增强作用［3-5］。此外，TFCC可能通过抑制成骨细胞凋亡对大鼠激素型骨质疏松症具较好的骨保护作用［6］，但其具体的分子机制尚不明确。含BED 型锌指蛋白3 反义RNA 1（zinc finger BED-type containing protein 3 antisense RNA 1，ZBED3-AS1）是近年来发现的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），可诱导间充质干细胞的成骨分化，提高骨再生能力［7］。然而TFCC 能否通过调控ZBED3-AS1 表达进而影响成骨细胞凋亡尚未可知。因此，本研究通过观察TFCC 对肿瘤坏死因子α（tu⁃mor necrosis factor-α，TNF-α）处理的成骨细胞增殖、凋亡及ZBED3-AS1表达的影响，揭示其分子机制，以期为TFCC用于防治骨质疏松提供实验依据。

材料和方法

1 实验材料和主要试剂

成骨样细胞株UMR-106购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM 培养液、胎牛血清和青-链霉素溶液购于Gibco；TNF-α 购于Sigma；TFCC 粉购于上海源叶生物科技有限公司；ZBED3-AS1 过表达载体（pcDNA3.1-ZBED3-AS1）及其对照（pcDNA3.1）、ZBED3-AS1 小干扰RNA（si-ZBED3-AS1）及其对照（si-NC）和PCR 引物由上海吉玛制药有限公司提供；CCK-8 购于日本同仁公司；annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液和Trizol 试剂盒购于上海碧云天生物科技公司；兔源caspase-3 抗体、兔源p21抗体和山羊抗兔IgG购于CST。

2 方法

2.1 细胞培养和转染 UMR-106 细胞采用DMEM培养液（添加10%的胎牛血清和1%的青-链霉素溶液）进行培养，按照1∶3 比例传代，每周换液2～3 次。将对数期UMR-106 细胞按照每孔2×105接种到6 孔板，当细胞融合度达到50%时，更换不含血清培养基。首先取50 pmol 的载体与适量无血清培养基混匀，使终体积为25 μL，记为混合物A。取1 μL 的Li⁃pofectamineTM2000 与24 μL 无血清培养基混匀，记为混合物B。静置5 min 后，将A 与B 混合，记为混合物C。室温静置15 min，将混合物C 加入到融合度约为50%的UMR-106 细胞中，6 h 后更换含血清培养基，转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

2.2 细胞分组和处理 UMR-106 细胞按照每孔2.5×104个接种于24 孔板，未转染的细胞分为对照（control）组（正常培养）、TNF-α 组（30 μg/L TNF-α 处理24 h［8］）、TNF-α+TFCC-1 组、TNF-α+TFCC-2 组、TNF-α+TFCC-3 组、TNF-α+TFCC-4 组 和TNF-α+TFCC-5 组，后5 组分别用含0.01、0.1、1、10 和100 μg/L TFCC+30 μg/L TNF-α 的 培 养 基培养。转染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1 的细胞用含30 μg/L TNF-α 的培养基培养，记为TNF-α+pcDNA3.1组和TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1组。转染si-NC、si-ZBED3-AS1、pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1的细胞用含100 μg/L TFCC 和30 μg/L TNF-α 的培养液共同培养。培养24 h后，收集细胞用于后续检测。

2.3 CCK-8 法检测细胞活力 将UMR-106 细胞按照每孔5×103（100 μL）接种于96 孔板，按照实验分组进行细胞处理后，每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂，反应2 h；同时设置空白孔，用酶标仪测量450 nm 波长处各孔细胞吸光度（A），计算细胞相对活力。细胞相对活力（%）=（实验组A 值-空白孔A 值）/（对照组A值-空白孔A值）×100%

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集上述各组细胞，采用结合缓冲液调整为密度1×109/L 的细胞悬液。按照annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒操作步骤，用流式细胞术测定各组细胞凋亡情况。

2.5 集落形成实验检测集落形成能力 用胰酶消化并收集各组UMR-106 细胞，按照每板100 个，每皿5 mL 接种于直径为60 mm 的平板，轻轻晃动使细胞分散均匀，培养至出现肉眼可见的细胞集落时，弃培养液，洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，显微镜下计数大于50个细胞的集落形成数。

2.6 Western blot 检 测p21 和caspase-3 蛋 白 的 表达 细胞按照上述分组进行处理后，加入RIPA 裂解液裂解细胞，获得细胞蛋白，进行浓度测定。取30 μg 蛋白样品上样进行SDS-PAGE，转膜后，5%脱脂牛奶常温封闭膜1 h，洗膜后将膜置于稀释的I 抗溶液中室温条件孵育2 h，洗膜后用稀释的II 抗溶液在室温条件孵育膜孵育1 h，加入化学发光显色试剂进行显影。目标蛋白的表达水平采用目标蛋白与内参照GAPDH蛋白灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 检测ZBED3-AS1 的表达 按照Trizol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA，采用核酸蛋白分析仪测定RNA 纯度，随后利用逆转录试剂盒合成cDNA，采 用SYBR Green 试 剂 盒 以2-ΔΔCt法 检 测ZBED3-AS1的表达水平。ZBED3-AS1的上游引物序列为5'-TACAACTTTGCATTAACCTTCC-3'，下游引物序列为5'-TGCCCTGTCCTCATGTTCG-3'；GAPDH的上游引物序列为5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'，下游引物序列为5'-GCGCCCAATACGAC⁃CAAATC-3'。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0 进行统计学分析，实验重复3次，数据用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞增殖的影响

与control 组比较，TNF-α 组UMR-106 细胞活力和集落形成能力显著降低，p21 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与TNF-α 组比较，TNF-α+TFCC-1 组和TNF-α+TFCC-2 组细胞活力、集落形成能力和p21 蛋白表达无显著变化；与TNF-α组比较，TNF-α+TFCC-3 组、TNF-α+TFCC-4 组和TNF-α+TFCC-5 组细胞活力和集落形成能力显著升高，p21 蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图1。

2 TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞凋亡的影响

与control 组比较，TNF-α 组UMR-106 细胞凋亡率和caspase-3 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与TNFα 组比较，TNF-α+TFCC-1 组和TNF-α+TFCC-2 组细胞凋亡率及caspase-3 蛋白表达无显著变化；与TNFα 组比较，TNF-α+TFCC-3 组、TNF-α+TFCC-4 组和TNF-α+TFCC-5 组细胞凋亡率和caspase-3 蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图2。

3 TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞ZBED3-AS1表达的影响

与control 组比 较，TNF-α 组UMR-106 细 胞中ZBED3-AS1 表达显著降低（P＜0.05）；与TNF-α 组比较，TNF-α+TFCC-1 组和TNF-α+TFCC-2 组细胞中ZBED3-AS1 表达无显著变化；与TNF-α 组比较，TNF-α+TFCC-3 组、TNF-α+TFCC-4 组和TNF-α+TF⁃CC-5 组细胞中ZBED3-AS1 表达显著升高（P＜0.05），见图3。

4 过表达ZBED3-AS1 对TNF-α 作用下UMR-106细胞增殖和凋亡的影响

与TNF-α+pcDNA3.1组比较，TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 组UMR-106 细胞活力和集落形成能力显著升高，凋亡率显著降低，p21 和caspase-3 蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图4。

5 抑制ZBED3-AS1 能减轻TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106细胞增殖和凋亡的影响

与TNF-α+TFCC-5+si-NC组比较，TNF-α+TFCC-5+si-ZBED3-AS1 组UMR-106 细 胞 中ZBED3-AS1 表达显著降低，细胞活力和集落形成能力显著降低，凋亡率显著升高，p21 和caspase-3 蛋白表达显著升高（P＜0.05），见图5。

6 过表达ZBED3-AS1 能增强TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106细胞增殖和凋亡的影响

与TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1 组比较，TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 组UMR-106 细 胞 中ZBED3-AS1 表达显著升高，细胞活力和集落形成能力显著升高，凋亡率显著降低，p21 和caspase-3 蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图6。

讨 论

长期以来，菟丝子被认为具有骨质疏松保护作用。赵素霞等［9］通过切除双侧大鼠卵巢法制备骨质疏松模型发现，TFCC 可增加去卵巢大鼠骨密度，改善骨质疏松症状。此外，多项体外细胞实验表明10%菟丝子含药血清和TFCC 均能够促进大鼠成骨细胞的增殖与分化，具有成骨促进作用［10-11］。TNF-α是骨质疏松组织中高表达的细胞因子之一，其可诱导成骨细胞凋亡，其诱导的成骨细胞是研究骨质疏松的常用体外细胞模型［8，12-13］。本研究发现，TNF-α诱导后UMR-106 细胞活力显著降低，凋亡率显著升高，而一定浓度的TFCC 干预后TNF-α 诱导的UMR-106 细胞凋亡率降低，活力和集落形成能力升高，提示TFCC 可提高成骨细胞的增殖能力，降低成骨细胞凋亡率。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-de⁃pendent kinases，CDKs）抑制剂家族中的重要成员，它通过抑制CDKs 复合物活性，阻滞细胞周期进程，从而发挥抗增殖作用，抑制p21 可推动成骨细胞周期完成，对骨质疏松症具有潜在治疗作用［14-15］。cas⁃pase-3是细胞凋亡的必经之路，其激活可引起细胞不可逆转的凋亡［16-17］。本研究发现，TNF-α 诱导后UMR-106 细胞中p21 和caspase-3 表达增加，而TFCC干预可显著降低p21 和caspase-3 的水平，与功能分析结果一致。以上研究提示，TFCC可减轻TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。

Figure 1. Effects of TFCC on the viability（A），colony-forming ability（B，C）and p21 protein expression（D）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.图1 TFCC对TNF-α作用下UMR-106细胞活力、集落形成能力及p21蛋白表达的影响

Figure 2. Effects of TFCC on apoptosis（A）and caspase-3 protein expression（B）in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD.n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.图2 TFCC对TNF-α作用下UMR-106细胞凋亡及caspase-3蛋白表达的影响

Figure 3. Effect of TFCC on the expression of ZBED3-AS1 in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.图3 TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞中ZBED3-AS1表达的影响

Figure 4. Effects of over-expression of ZBED3-AS1（A）on the viability（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+pcDNA3.1 group.图4 过表达ZBED3-AS1对TNF-α作用下UMR-106细胞活力、集落形成能力、凋亡及p21和caspase-3蛋白表达的影响

ZBED3-AS1 的基因位于5q13.3，研究显示ZBED3-AS1 在诱导软骨分化过程中上调，可促进人滑液间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的软骨分化，对骨关节炎的治疗具有重要意义［18-19］。此外，ZBED3-AS1通过靶向IL-1β可增加矿化结节数量，提高碱性磷酸酶活性，促进间充质干细胞增殖和成骨分化，提高骨再生能力［7］。本研究发现，一定浓度的TFCC 干预可升高TNF-α 诱导后UMR-106 细胞中ZBED3-AS1 的表达水平，提示TFCC 可能通过上调ZBED3-AS1表达来减轻TNF-α诱导后UMR-106细胞凋亡。进一步研究显示，过表达ZBED3-AS1 可提高TNF-α 诱导下UMR-106 细胞活力和集落形成能力，减轻TNF-α 诱导的UMR-106 细胞凋亡，并降低增殖抑制蛋白p21 和凋亡促进蛋白caspase-3 的表达水平，增强TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞活力、集落形成和凋亡的影响。抑制ZBED3-AS1表达则减轻TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞活力、集落形成和凋亡的影响。以上研究说明，上调ZBED3-AS1 表达是TFCC 对TNF-α 诱导的成骨细胞发挥保护作用的重要机制。

Figure 5. Inhibition of ZBED3-AS1（A）reduced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNFα+TFCC（100 μg/L）+si-NC group.图5 抑制ZBED3-AS1 能减轻TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表达的影响

Figure 6. Over-expression of ZBED3-AS1（A）enhanced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apopto⁃sis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+TFCC（100 μg/L）+pcDNA3.1 group.图6 过表达ZBED3-AS1 能增强TFCC 对TNF-α 作用下UMR-106 细胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表达的影响

综上所述，本研究证实TFCC 通过上调ZBED3-AS1 表达能够抑制TNF-α 引起的成骨细胞凋亡，促进细胞增殖，提示TFCC 在骨质疏松抗成骨细胞凋亡治疗方面具有潜在应用价值。