多肽C16/Ang1联合胎盘间充质干细胞对视神经脊髓炎大鼠的保护作用*

蒋进展， 付笑笑， 韩 曙， 王文倩， 丁明星， 陈浩浩△

（1金华职业技术学院医学院分子生物学实验室，浙江金华321000；2浙江大学医学院人体解剖与细胞生物系，浙江杭州310058）

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是一种视神经与脊髓同时受累的脱髓鞘病变，主要特征为导致失明的视神经炎，伴发脊髓炎和脑内炎症病灶所引起的瘫痪，是神经系统高致残疾病之一［1-2］。NMO 的主要发病机理［3-4］是血清中的NMO-IgG 特异性地结合和攻击位于星形胶质细胞的足突上的水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4），破坏了血脑屏障的完整性，使得淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞受到血管外趋化因子的影响逸出，激活星形胶质细胞并导致细胞依赖的细胞毒性反应，进一步恶化炎症微环境，从而导致神经元和少突胶质细胞的大量死亡。

对于NMO 的治疗，目前没有特别有效的方法，急性期主要使用大剂量激素冲击疗法和血浆置换疗法［5］。国内外在治疗NMO 的探索中，曾经尝试移植的干细胞治疗目前包括人脐血干细胞和自体的骨髓间质干细胞，并且显示了一定的治疗效果［6-7］。已有报道［8-9］证实间充质干细胞可以表达并分泌多种神经营养因子，促进神经干细胞的生长和分化，保护受损的神经元和诱导神经纤维再生。多肽C16（KAFDITYVRLKF）是血管内皮细胞所附着的基底膜上的重要基质分子层粘蛋白r1 链上的多肽，具有识别并与整合素特异性结合的作用，可以竞争性地阻断炎性细胞与血管内皮细胞之间受体与配体的识别［10-11］。同时，在我们既往的研究［12］显示，促血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）具有保护血管内皮细胞，降低中枢神经局部血管通透性，抑制T 淋巴细胞逸出等效应，在与C16 联合使用时可产生一定的协同作用，能进一步促进损伤后的功能恢复。本研究通过构建NMO 大鼠模型，在侧脑室及蛛网膜下隙移植胎盘来源间充质干细胞（placental-derived mesenchymal stem cells，PDMSCs），同时以尾静脉注射C16/Ang1，从神经行为学、病理组织学和分子生物学等多方位评价治疗效果，为NMO 治疗提供参考资料。

材料和方法

1 动物

SPF 级雄性Lewis 大鼠75 只，8～10 周龄，250～270 g，由浙江大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（浙）2012-0178。PDMSCs由孕18d大鼠的胎盘中分离提取［13］，本实验室保存，已连续传5代以上。

2 主要试剂

DMEM-F12培养液、胎牛血清和胰酶EDTA 等细胞培养相关试剂均购自Thermo Fisher Scientific；本实验用到的抗体均购自Abcam；多肽C16 及Ang1 由上海科肽生物科技有限公司合成；ELISA 检测试剂盒购自R&D Systems；SABC-HRP Kit 购自上海碧云天公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 NMO 动物模型的制备及分组干预 戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉，将APQ4 抗体（0.2 g/L）与人补体C5蛋白（5 g/L）各50 μL混合，参照本研究组以往的方法［14］，通过脑立体定位仪对大鼠进行脑室（AP-0.7 mm；ML-1.7 mm；depth-5 mm）和脊髓蛛网膜下隙（L4～L5）渗透性微泵注射（Alzet 1003D，1 μL/h），持续3 d，NMO模型构建完成。将实验动物分为5组，每组15 只，分别为正常对照组（normal 组）、NMO模 型 组（NMO 组）、NMO 模 型+PDMSCs 移 植 组（PDMSCs 组）、NMO 模型组+C16/Ang1 干预组（C16/Ang1 组）及NMO 模型+PDMSCs 移植+C16/Ang1 干预组（C16/Ang1+PDMSCs 组）。在NMO 模型构建完成后，PDMSCs组和C16/Ang1+PDMSCs组的动物经微泵注射移植PDMSCs，移植前2 h，收集细胞并计数，终浓度为1×1012/L，侧脑室内注射2 μL，脊髓蛛网膜下隙注射4 μL。在NMO 模型构建完成后1 d，C16/Ang1 组和C16/Ang1+PDMSCs 组的动物每日进行1 mL C16/Ang1混合物（含2 mg C16和400 μg Ang1）尾静脉注射给药，而其他组仅注射等体积生理盐水，持续2周。

3.2 神经行为学评分 NMO模型构建完成后，每天评估治疗大鼠的疾病严重程度，采用症状与评分量表［15］，即：0 分，正常；1 分，尾巴张力降低；2 分，跛尾，扶正受损；3 分，扶正消失；4 分，步态共济失调；5 分，后肢轻度瘫痪；6 分，后肢中度瘫痪；7 分，严重的瘫痪；8分，四肢瘫痪；9分，垂死；10分，死亡。

3.3 免疫组化 建模后第3和8周，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，每组3 只，并用冷生理盐水心内灌注，然后4%多聚甲醛灌注，取脊髓L4～L5 节段组织，外固定24 h，置于含30%蔗糖的PBS中直至组织沉到容器的底部，行20 μm 冰冻切片，抗体封闭液37℃封闭30 min，加兔抗CD45 抗体（1∶200）于4℃过夜，之后参照SABC-HRP Kit with Anti-Rabbit IgG进行后续步骤。

3.4 Nissl 染色 冰冻切片烘烤30 min，100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，70%乙醇3 min，超纯水清洗3 次，0.1%焦油紫（pH 3.0）于37℃染色5 min，超纯水洗涤3 次，70%乙醇60 s，95%乙醇60 s，100%乙醇60 s，分色液（同比例的乙醇+乙醚+氯仿）中分色20 s，100%乙醇5 min×3 次，二甲苯5 min×3 次，中性树脂封片，随机选择5 张切片（每张切片3 个视野，200倍）用于计数。

3.5 免疫荧光双标 抗体封闭液37℃封闭30 min，分别加兔抗神经丝蛋白200（neurofilament 200，NF200）抗体（1∶500）和小鼠抗髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗体（1∶200），在4℃过夜，FITC 标记的山羊抗兔IgG 和TRITC 标记的山羊抗小鼠IgG 于37℃孵育1 h，抗淬灭封片剂封片，随机选择每个样本5 个横切面（每个切片的3 个视野，200倍），进行脱髓鞘及轴索缺失评分，切片中红色显示髓鞘较为完整，绿色显示轴索较为完好。脱髓鞘评分标准［16］如下：1 分，极少量的脱髓鞘；2 分，部分区域脱髓鞘；3 分，血管周围融合成片状或软脊膜下脱髓鞘；4 分，大量血管周围或软脊膜下脱髓鞘；5分，广泛性血管周围或软脊膜下脱髓鞘。轴索缺失评分标准［17］如下：1 分，少量表面轴索缺失，少于25%组织；2 分，大量轴索缺失，超过25%的组织；3分，扩散和广泛轴索缺失。

3.6 Evans blue 染色 在建模后第3 周，麻醉大鼠，每组3 只，并在37℃用Evans blue（2%溶于0.9%生理盐水中，4 mL/kg）经右股静脉输注5 min，2 h 后，用300 mL 生理盐水灌注血管以洗掉剩余的染料，取脊髓L4～L5节段组织，进行冰冻切片，20 μm厚；荧光显微镜观察，在540 nm 激发波长下含渗出物的组织被染成红色。

3.7 血清ELISA 检测 在建模后第3 周及第8 周，麻醉大鼠，每组6 只，眼眶采血1 mL，通过ELISA 检测白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、IL-10 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

3.8 脊髓组织Western blot 检测 采血后的大鼠，每组3只，迅速断头，取脊髓L4～L5节段组织，蛋白裂解液，冰上研磨，BCA 法测定蛋白质浓度。取等量蛋白，加5×上样缓冲液沸水浴变性5 min；12%SDSPAGE 分离，80 V 30 min，120 V 100 min；冰盒转膜，200 mA 60 min；5% BSA 室温封闭60 min；兔抗cas⁃pase-3（1∶500）、兔抗GFAP（1∶200）、兔抗AQP4（1∶500）和兔抗tubulin（1∶1 000）于4℃孵育过夜；TBST洗3 次，每次10 min；HRP 标记山羊抗兔（1∶5 000）37℃孵育1 h；TBST 洗3 次，每次10 min；ECL A 液B液5 min，显影液3 min，定影液3 min，拍照。

4 统计学处理

数据采用SPSS 16.0 统计软件分析。所有数据均采用平均值±标准差（mean±SD）表示，对数据首先进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性的两组间数据分析采用独立样本t检验分析，多组间数据分析采用重复测量设计的方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 C16/Ang1+PDMSCs 干预降低NMO 大鼠的神经行为学评分

各组大鼠NMO 症状在第3 天开始出现，神经行为学评分显示NMO组在第2周左右达到高峰（7.33±0.65），而PDMSCs 组（评分为6.75±0.45）、C16/Ang组（评分为6.67±0.49）及C16/Ang1+PDMSCs 组（评分为5.50±0.67）在第3 周左右达到高峰，随后各组均逐渐下降。C16/Ang1+PDMSCs 组评分自第5 周始显著低于NMO 组（P＜0.05），并且在第5、7 和8 周时，显著低于PDMSCs 组（P＜0.05），在第5 和7 周时，评分显著低于C16/Ang1组（P＜0.05），见图1。

2 C16/Ang1+PDMSCs 干预减少炎症细胞的实质浸润和脊髓神经元丢失

在NMO 组中，建模后3周，脊髓组织都出现大量的CD45+炎症细胞浸润，并可见“血管周袖套”现象，PDMSCs 组和C16/Ang1 组中也出现炎症细胞浸润现象，而C16/Ang1+PDMSCs 组炎症细胞浸润较少，小血管完整性较好（图2）。

Nissl 染色显示，建模后8 周，在NMO 组中，脊髓神经元出现了大量的丢失，经过神经元计数显示，PDMSCs 组及C16/Ang1+PDMSCs 组神经元数量显著高于NMO组和C16/Ang1组（P＜0.05），见图3。

Figure 1. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the neurobehavioral score of NMO rats. Mean±SD. n=15. *P＜0.05 vs NMO group；#P＜0.05 vs PDMSCs group；△P＜0.05 vs C16/Ang1 group.图1 C16/Ang1+PDMSCs干预对NMO大鼠的神经行为学评分的影响

Figure 2. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected CD45+inflammatory cell infiltration in spinal cord tissue of NMO rats. A：nor⁃mal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1 group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The red arrows indi⁃cated inflammatory cell infiltration. The scale bar=100 μm.图2 C16/Ang1+PDMSCs干预对NMO大鼠脊髓组织CD45+炎症细胞浸润的影响

Figure 3. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the neuron numbers in rat spinal cord 8 weeks after modeling. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The white arrows indi⁃cated Nissl staining-positive neurons. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.图3 C16/Ang1+PDMSCs干预对建模后8周大鼠脊髓神经元数量的影响

3 C16/Ang1+PDMSCs 干预改善脊髓脱髓鞘、轴索缺失及血管通透性

NMO 组中脊髓出现大量的MBP（红色）脱失现象，NF-200（绿色）在疾病后期也出现减少（图4）。轴索缺失评分显示，建模后8 周，C16/Ang1+PDMSCs组显著低于好于NMO 组及C16/Ang1 组（P＜0.05）；脱髓鞘评分显示，C16/Ang1+PDMSCs 组的显著低于NMO 组、C16/Ang1 组及PDMSCs 组（P＜0.05），见图4。Evans blue 染色显示，NMO 组中出现大量红色标记，而C16/Ang1+PDMSCs组红色标记减少（图5）。

4 C16/Ang1+PDMSCs 干 预 促 进 脊 髓GFAP 和APQ4的表达，并下调caspase-3

Figure 4. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected axonal loss and demyelination in rat spinal cord. Double immunofluorescence staining images of the transverse sections through the anterior horn of the lumbar spinal cord showing the distribution of myelin basic protein（MBP，red）and neurofilament 200（NF200，green）. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；#P＜0.05 vs C16/Ang1 group.图4 C16/Ang1+PDMSCs干预对大鼠脊髓组织轴索缺失和脱髓鞘的影响

Figure 5. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the vascular permeability in rat spinal cord tissue. A：normal group；B：NMO group；C：PDMSCs group；D：C16/Ang1 group；E：C16/Ang1+PDMSCs group. The blue arrows indicated Evans blue staining of the spinal cord（red）. The scale bar=100 μm.图5 C16/Ang1+PDMSCs干预对大鼠脊髓组织血管通透性的影响

Western blot 结果显示，在建模后第3 周及第8周，与normal 组相比，NMO 组脊髓组织caspase-3 表达显著增加，GFAP 和APQ4 表达显著下降（P＜0.05）；与NMO 组相比，C16/Ang1+PDMSCs 组在第3周及第8周APQ4表达显著升高（P＜0.05），caspase-3表达显著下降（P＜0.05）；与PDMSCs 组及C16/Ang1组相比，C16/Ang1+PDMSCs 组在第3 周APQ4 表达显著升高（P＜0.05），caspase-3 表达显著下降（P＜0.05），在第8 周GFAP 表达显著升高（P＜0.05），见图6。

5 C16/Ang1+PDMSCs 干 预 下 调IL-1β、IL-8 和TNF-α，并上调IL-10

血清ELISA 检测显示，与NMO 组相比，C16/Ang1组及C16/Ang1+PDMSCs组促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α 水平均显著降低（P＜0.05），抗炎细胞因子IL-10 则显著升高（P＜0.05）；与PDMSCs 组相比，C16/Ang1+PDMSCs 组IL-1β、IL-8 和TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），IL-10 水平在第3 周显著升高（P＜0.05）；与C16/Ang1组比较，C16/Ang1+PDMSCs组在第8周出现IL-1β及IL-10显著降低（图7）。

讨 论

NMO 患者主要表现为视力急剧下降甚至失明，双侧下肢瘫痪及感觉障碍［2］。病理检测镜下可见脊髓肿胀软化部位病变累及脊髓灰质和白质，轴索和神经细胞丢失，中性粒细胞浸润，毛细血管增生，血管周围淋巴细胞袖套样浸润，另可见散在或融合成片的脱髓鞘改变，上行及下行神经纤维束Wallerian变性［18］。在本研究中，我们通过脑室及蛛网膜下腔注射APQ4 抗体与人补体C5 蛋白诱导了NMO 动物模型，该模型再现了NMO 病理学的特征和症状，这与其他研究结果基本一致［1，3］。

Figure 6. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected GFAP，APQ4 and caspase-3 expression levels in rat spinal cord（detected by Western blot）. A：3 weeks；B：8 weeks. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.图6 C16/Ang1+PDMSCs干预对大鼠脊髓中GFAP、APQ4和caspase-3表达水平的影响

Figure 7. Treatment with C16/Ang1+PDMSCs affected the levels of IL-1β，IL-8，TNF-α and IL-10 in rat serum（detected by ELI⁃SA）. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs NMO group；△P＜0.05 vs PDMSCs group；▲P＜0.05 vs C16/Ang1 group.图7 C16/Ang1+PDMSCs干预对大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α及IL-10水平的影响

NMO-IgG 通过血脑屏障，遇到星形胶质细胞并导致细胞依赖的细胞毒性反应，星形胶质细胞足突被NMO-IgG和补体降解，继而活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞，一起产生细胞因子、氧自由基等造成血管和脑实质损伤，最终导致包括轴索和少突胶质细胞在内的白质和灰质的损伤［19］。抗炎疗法可以保护运动神经元，缓解神经症状［20］，另外修复血管完整性和促进血管生成可以潜在地减少NMO-IgG介导的星形胶质细胞损伤和AQP4 损失［21］。间充质干细胞在治疗神经系统疾病中，具有一定的免疫调节功能［22-23］，可抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡。以往研究显示，C16/Ang-1具有保护血管内皮细胞、抑制T 淋巴细胞血管外逸出和组织内浸润的效应，其中C16 与整合素结合后激活Ang1/Tie2-PI3K/Akt 的上游通路，使得内皮细胞得以存活，促进了血管生成［12，24］。在本研究中，我们将C16/Ang1与PDMSCs联合对NMO模型动物进行了干预治疗，结果显示，动物神经行为学评分峰值延后，8周时的评分高于其他几组，提示其对改善NMO 疾病进程有一定的效果。在C16/Ang1+PDMSCs 干预后3周及8 周，我们进行了组织学的检测，炎细胞浸润较少，而NMO 组能见到明显的“血管周袖套”现象，此外，C16/Ang1+PDMSCs组动物脊髓组织脱髓鞘、轴索缺失及血管通透性增加等现象得到改善。

血脑屏障的破坏是NMO 进展的标志［25］。有回顾性研究表明NMO 患者入院时血脑屏障通透性越高，其肢体残疾发生的程度越高［26］，循环炎性细胞因子如TNF-α、IL-1 和IL-8 与血脑屏障分解有关，血管通透性的增加促进了NMO-IgG抗体进入中枢神经组织中［3，18］。有学者通过给NMO 患者静脉注射自体骨髓间充质干细胞，取得了一定的疗效，其可能通过调低Thf细胞及其因子IL-6 和IL-21 从而起到神经保护作用［27］。在本研究中，建模后3 周，与PDMSCs 组相比，C16/Ang1 组及C16/Ang1+PDMSCs 组血清中促炎因子IL-1β、IL-8 和TNF-α 相对于都显著降低，IL-10则显著升高，这提示炎症细胞因子的变化可能与C16/Ang1 的作用有更密切的关联，另外还可能是本研究是将细胞注射移植进入动物的脑室和蛛网膜下隙内。

由于NMO⁃IgG 对星形胶质细胞的破坏作用，其特异性标记物GFAP会在病变部位大量脱失，本研究中，通过Western blot对脊髓组织的GFAP 和APQ4的表达进行检测，建模后3 周时，3 组干预组GFAP 和APQ4 的水平未见明显变化，8 周C16/Ang1+PDMSCs组显著高于其他2 组。同时，caspase-3 的表达水平在建模后3 周时，C16/Ang1+PDMSCs 组显著低于其他2组，这提示，PDMSCs与C16/Ang1联合治疗，可以一定程度促进星形胶质细胞的恢复，抑制细胞凋亡的发生。此外，我们还对建模后8 周脊髓组织进行了Nissl 染色观察并计数神经元的数量，结果显示，NMO 模型大鼠的脊髓神经元出现了大量的丢失，而PDMSCs 组及C16/Ang1+PDMSCs 组中这一现象皆出现改善，并且这两组神经元数量都显著高于C16/Ang1 组，提示神经元数量的差异跟PDMSCs 移植有密切的关系。我们推测，PDMSCs 通过分泌营养因子，可减少内源性细胞凋亡［28］，另外C16/Ang1 能促进血管生成，两者之间可能存在一定的协同效应，从而促进了NMO动物的恢复。

综上所述，C16/Ang1 与PDMSCs 移植进行联合治疗NMO 时，能够有效改善NMO 的疾病进程，其主要通过抑制炎性细胞浸润及内源性细胞凋亡，从而改善局部微环境，加速神经功能的恢复，此外两者之间还可能有一定的协同作用，但其具体机制还需要进一步深入探索，为今后的药物转化和治疗提供参考。