lncRNA LINC00339通过下调miR-149-5p表达调控ox-LDL诱导的人脑微血管内皮细胞损伤*

王进鹏， 龙启福， 雷延成， 张 豪， 林存山△

（1青海省人民医院神经内科，2青海大学医学院基础医学研究中心，青海西宁810007）

脑血管疾病是严重危害人类健康的一类疾病，致死率和致残率都很高，脑微血管内皮细胞不仅是组织与血液之间的屏障，而且还具有多种分泌功能，因此，微血管内皮细胞的损伤与脑血管疾病的发生、发展有着密切的关系［1-2］。研究报道微小RNA-149-5p（microRNA-149-5p，miR-149-5p）在短暂性大脑中动脉栓塞模型大鼠和氧糖剥夺/复氧模型处理后的细胞中显著下降，miR-149-5p 通过靶向S1PR2 减轻大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障的通透性［3］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）MIAT通过miR-149-5p 靶向调控CD47 导致巨噬细胞胞葬障碍，从而促进动脉粥样硬化斑块的进展和不稳定［4］。以上研究表明miR-149-5p 影响脑血管相关疾病的发生，且受到lncRNA 的调控。另有研究表明，lncRNA 在动脉粥样硬化、卒中、动脉瘤等血管相关疾病中也发挥重要作用［5］。我们通过在线软件预测到miR-149-5p 与lncRNA LINC00339 有结合位点。有研究报道，LINC00339 高表达通过调节miR-22-3p/NLRP3 信号通路促进草酸钙诱导的肾小管上皮细胞凋亡［6］。LINC00339 在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中高表达，敲除LINC00339通过miR-484可提高心肌细胞活力并减少细胞凋亡［7］。以上研究表明LINC00339 可影响细胞凋亡过程。然而LINC00339对人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）凋亡和氧化应激反应的影响及机制尚不清楚。因此，本研究通过用氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导HBMEC 凋亡和氧化应激反应，探讨LINC00339对ox-LDL 诱导的HBMEC 凋亡和氧化应激反应的影响及其机制是否与miR-149-5p有关。

材料和方法

1 材料

HBMEC 及内皮细胞培养基购自Sciencell；胎牛血清购自Gibco；ox-LDL 购自上海经科化学科技有限公司；Trizol 试剂、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞处理与分组 HBMEC 用含10%胎牛血清的内皮细胞培养基在37℃、5% CO2条件下培养。取对数生长期HBMEC，用50 mg/L ox-LDL 处理，记为ox-LDL 组；对照（control）组仅加入等量培养基进行常规培养；将LINC00339 的抑制表达载体（si-LINC00339）及其阴性对照（si-NC），以及miR-149-5p模拟物及其阴性对照（miR-NC）分别转染至HBMEC后用50 mg/L ox-LDL 处理，分别记为ox-LDL+si-NC组、ox-LDL+si-LINC00339 组、ox-LDL+miR-NC 组 和ox-LDL+miR-149-5p 组；将si-LINC00339 分别与miR-149-5p 的抑制表达载体（anti-miR-149-5p）及其阴性对照（anti-miR-NC）共转染至HBMEC 后用50 mg/L ox-LDL 处 理，记 为ox-LDL+si-LINC00339+anti-miRNC组和ox-LDL+si-LINC00339+anti-miR-149-5p组。

2.2 RT-qPCR 检 测LINC00339 和miR-149-5p 的 表达水平 各组细胞培养48 h，提取总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒使用说明进行PCR，反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40 个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-ΔΔCt法计算。LINC00339 和miR-149-5p 分 别 以GAPDH 和U6 为 内参照。LINC00339 的上游引物序列为5'-GGTTGAC⁃GAAGTCTGGAACG-3'，下 游 引 物 序 列 为 5'-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3'；GAPDH 的上游引物序列为5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物序列为5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'； miR-149-5p 的 上 游 引 物 序 列 为 5'-GTCTTCACTCCCGTGCTTGT-3'，下游引物序列为5'-CCCGAAACACCCGTAAGATA-3'；U6 的上游引物序列为5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列为5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

2.3 MDA 含量及SOD 和CAT 活性的检测 细胞培养48 h 后收集各组细胞，按用MDA、SOD 和CAT 检测试剂盒说明书进行操作。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h，用预冷的PBS 漂洗2 次，加入10 μL 的annexin VFITC，再加入5 μL 的PI，混匀后避光孵育10 min；用流式细胞术检测细胞凋亡率。

2.5 Western blot 法检测Bcl-2 和Bax 蛋白表达 提取总蛋白并用BCA 法进行定量，然后取50 μL 蛋白样品进行SDS-PAGE，电泳结束后经过电转将蛋白样品转移到PVDF 膜上，转膜结束后用用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，封闭结束后倒掉封闭液，将膜用TBST清洗后加入Ⅰ抗（1∶800）4℃孵育过夜，然后倒掉Ⅰ抗，再用TBST 洗膜，洗涤3 次后加入HRP 标记的Ⅱ抗（1∶1 000），室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，洗涤3次后加入ECL 显色液进行显色，接着在暗室下通过X线对胶片进行显影、定影。最后用Quantity One 软件分析蛋白条带灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参照GAPDH灰度值。

2.6 双萤光素酶报告基因实验检测LINC00339 对miR-149-5p 的靶向调控 使用PCR 扩增包含miR-149-5p 结合位点的LINC00339 序列片段，并构建至萤光素酶表达载体中，获得LINC00339 野生型载体（WT-LINC00339）；将LINC00339 部分序列（GCC⁃GAGGAGCCAGA）突变为UCAGAUCCAUACG，获得LINC00339 突变型载体（MUT-LINC00339）；将WTLINC00339 和MUT-LINC00339 分 别 与miR-NC 和miR-149-5p 用Lipofectamine 2000 共转染至HBMEC中；转染48 h后，根据双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明检测萤光素酶活性。将si-NC、si-LINC00339、pcDNA 和pcDNA-LINC00339 转 染至HBMEC 中，按2.2中的方法检测miR-149-5p表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较行t 检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 LINC00339 和miR-149-5p 在ox-LDL 诱 导 的HBMEC中的表达

RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，用50 mg/L ox-LDL 处理的HBMEC 中LINC00339 的表达水平显著升高，miR-149-5p的表达水平显著降低（P＜0.05），见表1。以上结果表明，ox-LDL 可提高HBMEC 中LINC00339的表达，降低miR-149-5p的表达。

表1 LINC00339 和miR-149-5p 在ox-LDL 诱 导的HBMEC中的表达Table 1. The expression of LINC00339 and miR-149-5p in HBMEC induced by ox-LDL（Mean±SD. n=9）

2 抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化应激的影响

HBMEC 经ox-LDL 诱导后LINC00339 的表达水平升高，MDA 的含量升高，SOD 和CAT 的活性降低（P＜0.05）；然而转染si-LINC00339 后再经ox-LDL 处理，HBMEC 中LINC00339的表达水平降低，MDA 含量降低，SOD 和CAT 活性升高（P＜0.05），见表2。以上结果表明，ox-LDL 可诱导HBMEC 氧化应激的产生，而抑制LINC00339 表达可减弱ox-LDL 诱导的HBMEC氧化应激。

表2 抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化应激的影响Table 2. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced oxidative stress in HBMEC（Mean±SD. n=9）

3 抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC凋亡的影响

流式细胞术结果显示，ox-LDL 诱导的HBMEC凋亡率升高，Western blot 检测结果显示，ox-LDL 诱导的HBMEC 中凋亡相关蛋白Bcl-2 的表达水平降低，Bax 的表达水平升高（P＜0.05）；而转染si-LINC00339后再经ox-LDL处理，HBMEC的凋亡率降低，Bcl-2 表达水平升高，Bax 表达水平降低（P＜0.05），见图1 及表3。以上结果表明，ox-LDL 可诱导HBMEC 凋亡，而抑制LINC00339 表达可降低ox-LDL诱导的HBMEC凋亡率。

Figure 1. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC. A：the images of Western blot for determining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apopto⁃sis of HBMEC.图1 抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC凋亡的影响

表3 抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC凋亡的影响Table 3. The effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC（Mean±SD. n=9）

4 LINC00339靶向调控miR-149-5p的表达

LncBase Predicted v2 在线软件预测结果显示，LINC00339 的序列中含有与miR-149-5p 互补的核苷酸序列，见图2A。 将miR-149-5p 分别与WTLINC00339 和MUT-LINC00339 共转染至HBMEC 中，再检测转染后细胞的萤光素酶活性，结果显示，miR-149-5p 与WT-LINC00339 共转染的细胞萤光素酶 活 性 降 低（P＜0.05），而miR-149-5p 与MUTLINC00339 共转染的细胞萤光素酶活性无显著变化（P＞0.05），见 图2B。RT-qPCR 结 果 显 示，转 染LINC00339 的过表达载体后miR-149-5p 的表达水平降低；而转染LINC00339 的抑制表达载体后miR-149-5p 表达水平升高（P＜0.05），见图2C。以上结果表明LINC00339可靶向负调控miR-149-5p的表达。

5 miR-149-5p 过表达对ox-LDL 诱导的HBMEC氧化损伤的影响

转染miR-149-5p 模拟物后再用ox-LDL 处理细胞，结果显示miR-149-5p 的表达水平升高，MDA 含量降低，SOD和CAT活性升高；流式细胞术检测结果显示，细胞凋亡率降低；Western blot检测结果显示，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低（P＜0.05），见图3 及表4。以上结果表明，过表达miR-149-5p 可抑制ox-LDL诱导的HBMEC发生氧化应激和凋亡。

6 敲减miR-149-5p 表达逆转了抑制LINC00339 表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化损伤的作用

将LINC00339 抑制表达载体和miR-149-5p 抑制表达载体共转染至HBMEC 后用ox-LDL 处理，结果显示，MDA 含量升高，SOD 和CAT 活性降低；流式细胞术检测结果显示，细胞凋亡率升高；Western blot检测结果显示，Bcl-2表达水平降低，Bax 表达水平升高（P＜0.05），见图4 及表5。以上结果表明，抑制miR-149-5p 表达可逆转抑制LINC00339 表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化应激和凋亡的影响。

Figure 2. LINC00339 targeted miR-149-5p and regulated the expression of miR-149-5p. A：LINC00339 contained a nucleotide se⁃quence complementary to miR-149-5p；B：dual-luciferase reporter experiment；C：LINC00339 regulated the expression of miR-149-5p. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNA group；&P＜0.05 vs si-NC group.图2 LINC00339靶向调控miR-149-5p的表达

Figure 3. The effect of miR-149-5p over-expression on ox-LDL-induced apoptosis of HBMEC. A：the images of Western blot for de⁃termining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of HBMEC.图3 miR-149-5p过表达对ox-LDL诱导的HBMEC凋亡的影响

表4 miR-149-5p过表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化损伤的影响Table 4. The effect of miR-149-5p over-expression on ox-LDL-induced oxidative damage of HBMEC（Mean±SD. n=9）

讨 论

Figure 4. Knock-down of miR-149-5p expression reversed the effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced apopto⁃sis of HBMEC. A：the images of Western blot for determining the protein expression of apoptosis-related molecules；B：the images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of HBMEC.图4 敲减miR-149-5p表达逆转了抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC凋亡的作用

表5 敲减miR-149-5p表达逆转了抑制LINC00339表达对ox-LDL诱导的HBMEC氧化损伤的作用Table 5. Knock-down of miR-149-5p expression reversed the effect of LINC00339 expression inhibition on ox-LDL-induced oxidative damage of HBMEC（Mean±SD. n=9）

脑微血管内皮细胞作为构成血脑屏障的主要结构基础，在中枢神经系统中的血管内外物质交换中发挥着重要的作用，与脑缺血、脑水肿等脑血管疾病的病理过程密切相关［8］。ox-LDL 是引起血管内皮细胞损伤的重要因素，常用于诱导细胞损伤，建立细胞损伤模型［9］。因此，本实验通过用ox-LDL 诱导HB⁃MEC 建立细胞氧化损伤模型，结果显示，ox-LDL 诱导的HBMEC凋亡增多，MDA含量升高，SOD和CAT活性降低。研究表明MDA 是脂质过氧化反应的终产物，可间接反映细胞氧化损伤程度；SOD 和CAT是细胞内清除氧自由基的抗氧化酶，可保护细胞免受损伤［10］。因此，以上结果表明，ox-LDL 诱导的HBMEC氧化损伤模型建立成功。

miRNA 几乎参与所有生命活动和多种疾病的发生发展过程，在缺血性脑卒中亦发挥着重要作用，研究其机制可为缺血性脑卒中的诊断、治疗及预后提供新的策略［11］。研究报道miR-149-5p在缺血再灌注脑损伤中低表达，miR-149-5p 表达上调后减轻了脑缺血再灌注的损伤［12］。过表达miR-149-5p可抑制高糖诱导的胰岛β 细胞凋亡，并减弱活性氧的产生［13］。miR-149-5p减轻了ox-LDL引起的人血管内皮细胞内皮损伤［14］。以上结果表明miR-149-5p可能具有减弱细胞氧化应激及细胞损伤的作用。本实验结果显示，ox-LDL 诱 导的HBMEC 中miR-149-5p 表 达水平降低；为研究miR-149-5p 对ox-LDL 诱导的HBMEC凋亡和氧化应激的影响，本实验在转染miR-149-5p的过表达载体后用ox-LDL 处理HBMEC 凋亡，结果显示MDA 含量降低，SOD 和CAT 活性升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达水平升高，Bax 表达水平降低。这表明miR-149-5p 过表达可抑制ox-LDL 诱导的HBMEC凋亡和氧化应激反应。

为进一步研究miR-149-5p 对HBMEC 凋亡和氧化应激影响的可能机制，本实验通过在线软件预测了与miR-149-5p 可能结合的lncRNA，结果发现LINC00339 与miR-149-5p 具有结合位点，且本实验还证实LINC00339 可靶向调控miR-149-5p 的表达。本实验检测了ox-LDL 诱导的HBMEC 中LINC00339的表达，结果发现LINC00339 表达水平升高；本实验进一步抑制LINC00339 表达，结果显示ox-LDL 诱导的HBMEC中MDA含量降低，SOD和CAT活性升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2 表达水平升高，Bax 表达水平降低。这表明抑制LINC00339 表达可抑制ox-LDL诱导的HBMEC 凋亡和氧化应激反应。此外，本实验同时抑制miR-149-5p 和LINC00339 表达后，ox-LDL诱导的HBMEC 中MDA 含量升高，SOD 和CAT 活性降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2 表达水平降低，Bax 表达水平升高。这表明抑制miR-149-5p表达可逆转抑制LINC00339 表达对ox-LDL 诱导的HBMEC 氧化损伤的作用。

综上所述，抑制LINC00339 表达可能通过上调miR-149-5p 表达抑制ox-LDL 诱导的HBMEC 凋亡和氧化应激反应，对HBMEC损伤具有一定保护作用。