蒙药瞿麦对小鼠的毒性作用研究

张 楠 张子英 王学梅 迟宝峰 苏志刚 曹晓东

1.内蒙古医科大学公共卫生学院慢性病分子流行病实验室，内蒙古呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学GLP中心，内蒙古呼和浩特 010110

瞿麦（Dianthus superbus L）是传统的蒙医常用药之一。蒙药名为高优-巴沙嘎，属石竹科多年生草本植物[1]。临床应用广泛，在玉簪清咽十五味散（丸）、肋柱花四味汤散、枫香脂十味丸、清肝九味散、沉香安神散等中均含有瞿麦[2]。研究表明，瞿麦具有兴奋子宫、抑制细胞毒性、免疫调节、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及利尿等作用[3]；在抗肝病毒、止痛、扩张血管、降低血压及兴奋肠管等方面也具有积极影响[2，4]。

关于瞿麦所产生的生物效应及机制研究，目前国内外主要关注的是化学成分及其药理作用[4]。张建梅等[5]发现，栝楼瞿麦丸对糖尿病肾病大鼠肾脏有一定的保护作用。郑桂敏等[6]用加减瓜蒌瞿麦丸治疗复发性尿路感染的患者时发现，与应用呋喃妥因治疗的患者相比，加减瓜蒌瞿麦丸有一定的疗效且可有效控制复发率，并能改善患者细胞免疫功能。

据国内外文献报道，目前从瞿麦中分离得到的化合物主要有皂苷类[7]、环肽类[8]、黄酮类、蒽醌类及有机酸类等，还含有少量的挥发油类、生物碱类[9]。根据文献研究，皂苷具有肝脏毒性、肾脏毒性、胃肠道毒性、心脏毒性、遗传毒性等[10-14]。蒽醌对肾、皮肤、膀胱、脾、甲状腺、肝等有毒性作用[11]。同样，含有皂苷和蒽醌类等成分的瞿麦可能也存在毒性。

通过上述文献报道发现，有关瞿麦的毒理作用研究十分少见，在《中华人民共和国药典（2015版）》[15]中也缺乏相关毒性作用的记载，且未见相关机制的研究。但是，研究瞿麦的毒理作用有助于推广该药的广泛应用，使临床应用更加合理。鉴于此，本研究通过短期给药探索瞿麦对小鼠的潜在毒性作用，初步探讨引起潜在毒性的剂量、靶器官和毒性机制，为瞿麦安全性评价提供科学依据，为临床用药提供安全信息。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康的清洁级昆明种成年小鼠，购自内蒙古医科大学实验动物中心[批准号：SCXK（蒙） 2015-0001]，18～ 22 g，雌雄各半，随机分为四组，每组各10只。

1.1.2 实验试剂及仪器 瞿麦（河北万修药业有限公司），生理盐水（江西科达卫生用品公司），苏木精-伊红染色液（安徽雷根生物技术有限公司），甲醛（天津市风船化学试剂科技有限公司），总RNA小量制备试剂盒（Axygen公司），cDNA制备试剂盒（Vazyme公司），荧光染料（罗氏）。

1.2 实验方法

1.2.1 瞿麦水煎剂的制备 称取50 g瞿麦，加入超纯水，大火煎开后转小火煎1 h，滤出药液，同样方法煎第2次，两次药液混匀后，蒸发浓缩。

1.2.2 实验动物分组与染毒 剂量设计采用临床剂量法（ACD法）：根据《中华人民共和国药典》规定，成人瞿麦每日用量为9～15 g，按成人标准体重60 kg算，本实验设计的瞿麦高剂量为2.5 g/ml大约相当于临床剂量的30倍。在该剂量下设定低、中剂量为0.25、0.5 g/ml，分别约相当于临床剂量的5、10倍。临床上瞿麦的给药途径通常为口服，而本实验考虑到胃内容物对药物剂量的影响以及药物在胃内的首过消除效应，为确保给予实验动物的药物剂量准确，故选择腹腔注射途径给药。

40只昆明种小鼠随机分为瞿麦水煎剂高、中、低剂量组，空白对照组，每组各10只。瞿麦水煎剂各剂量组每日腹腔注射给药1次，空白对照组腹腔注射给予同体积生理盐水，连续给药7 d。

1.2.3 实验动物的一般观察 实验过程中每日给药前后对小鼠的行为、活动、饮食饮水、毛色、粪便等变化进行观察，并观察注药后小鼠的中毒反应。

1.2.4 肝、肾功能测定 眼眶静脉丛取血至离心管，以2500 r/min，离心15 min后取上清液，用全自动生化仪进行血液肝、肾功能检测。

1.2.5 实验动物处理及取材 脱颈椎处死后称重，解剖暴露肝、肾、肺、脾脏，将其完整剥离，用生理盐水冲洗以去除残留血液，将其浸泡于10%甲醛溶液中固定。

1.2.6 脏器指数测定 用电子天平准确称量小鼠体重及肝、肾、肺、脾脏湿质量，记录数据，并用肝、肾、肺、脾脏重量/体重，分别计算各脏器指数。

1.2.7 组织病理学检测 制作组织病理切片，苏木精 -伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色法染色，封片光镜观察，在光学显微镜目镜10×，物镜10×、20×、40×下观察组织学变化。

1.2.8 肾组织总RNA的提取、cDNA的制备及qPCR检测 按照 Axygen公司总RNA小量制备试剂盒说明书提取组织RNA；按照Vazyme公司HiscriptQRTSSuperMix试剂盒说明，获得cDNA。总RNA上样量为2.0 μl（约500 ng），反应条件：25 ℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。实时荧光定量PCR以制备的cDNA为模板，利用合成的特异性引物，通过qPCR方法扩增GAPDH、有机阴离子转运蛋白1（OAT1）和有机阴离子转运蛋白3（OAT3）的基因。反应条件是预变性95 ℃10 s，变性95 ℃ 5 s，退火 60 ℃ 34 s，共 40 个循环；从 65 ℃到95 ℃制作融解曲线。

qPCR所获得的数据，利用2-△Ct（△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值）公式进行目的基因在肾组织上相对表达量计算。见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（）表示，当满足正态性和方差齐时采用单因素方差分析，当不满足时用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 qPCR中的引物序列及扩增片段大小

2 结果

2.1 各组一般观察

实验期间，瞿麦高剂量组和中剂量组的小鼠在腹腔注射后7 min左右出现明显的腹部抽搐、蜷缩的症状，低剂量组有轻微的腹部抽搐的症状。高、中剂量组饮食饮水均下降，被毛缺乏光泽。在整个实验过程中，高剂量组死亡小鼠共计6只，中剂量组4只。

2.2 各组肝、肾脏血生化检测

瞿麦高剂量组升高了小鼠尿酸（uric acid，UA）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量；瞿麦低剂量组升高乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量。见图1。

图1 瞿麦对小鼠血生化的影响[瞿麦肾脏血生化检测（A），瞿麦肝脏血生化检测（B）]

2.3 各组肝、肾、肺、脾脏指数

瞿麦高、中剂量可显著增加小鼠肾脏及肺脏指数；瞿麦低剂量能显著增加小鼠脾脏指数。见图2。

图2 瞿麦对小鼠脏器指数的影响[瞿麦肾脏指数（A），瞿麦肝脏指数（B），瞿麦肺脏指数（C），瞿麦脾脏指数（D）]

2.4 各组肝、肾、肺、脾组织病理结果

随着剂量的增加，肝脏组织边缘区域逐渐出现凝固性坏死，坏死肝细胞周围肝细胞气球样变，细胞核固缩，炎症细胞浸润。见图3。

随着剂量的增加，肾组织被膜逐渐增厚，被膜内疏松结缔组织增长，炎症细胞浸润；肾皮质内管腔逐渐狭窄，管腔不规则；皮质内小管的上皮细胞体积增大，胞浆疏松，淡染，内有空泡，且症状随着剂量的增加而加重，胞质流失，细胞坏死细胞核也逐渐消失。说明药物对小鼠的肾组织有所损伤。见图4。

随着剂量的增加，肺脏组织出现肺泡内偶见蛋白渗出，肺泡壁炎症细胞浸润。见图5。

随着剂量的增加，脾脏组织被膜下，淋巴细胞减少，生发中心体积变小，边缘区细胞丢失。见图6。

图3 瞿麦对小鼠肝脏组织的病理学检测结果

图4 瞿麦对小鼠肾脏组织的病理学检测结果

图5 瞿麦对小鼠肺脏组织的病理学检测结果

图6 瞿麦对小鼠脾脏组织的病理学检测结果

2.5 肾脏损伤基因检测

与空白组比较，瞿麦高剂量组能够极显著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表达；瞿麦中、低剂量组可以显著抑制OAT1和OAT3 mRNA的表达。

图6 麦对小鼠肾脏中有机阴离子转运体OAT1和OAT3 mRNA的影响[瞿麦对小鼠肾脏中有机阴离子转运体OAT1 mRNA的影响（A），瞿麦对小鼠肾脏中有机阴离子转运体OAT3 mRNA的影响（B）]

3 讨论

本研究采用不同剂量的瞿麦水煎剂，通过肝、肾功能的血生化检测，脏器指数分析，组织病理学检测小鼠主要脏器组织形态变化；利用qPCR检测了有机阴离子转运体OAT1和OAT3在瞿麦引起小鼠毒性损伤中的作用。结果显示，瞿麦中、高剂量组对小鼠各主要脏器均有不同程度的损伤，且肾脏尤为严重。因此，本研究探索瞿麦对小鼠肾脏损伤的分子机制，发现瞿麦各剂量组可不同程度的抑制有机阴离子转运体mRNA的表达。

研究表明，瞿麦水煎剂会导致妊娠期小鼠在早、中期出现流产、死胎[3]。但是，瞿麦是否对肾脏、肝脏等主要脏器造成毒性还鲜有报道。目前，用于检测肾、肝脏损害的毒性作用最常用的是血液生化检测，尿肌酐和血尿素氮的浓度取决于肾排泄能力，可以在一定程度上反映肾小球滤过功能的损害程度，而ALP、ALT和AST是主要反映肝功能受损的指标。但血液生化检测灵敏度较低，通常是在肾、肝脏组织已出现中度以上的明显损伤后才升高[16]。本研究结果也显示，瞿麦高剂量组升高了小鼠UA和BUN的含量，瞿麦低剂量组升高了LDH、ALP、AST的含量，但结果差异无统计学意义。病理结果表明，瞿麦对肝脏、肾脏已经有了明显的损害，且肾脏病理学改变更严重。药物对脏器系数的影响可以作为动物脏器损伤的初步指标。随着瞿麦剂量的增加，肾脏系数也逐渐增加。因此，推断肾脏是瞿麦产生毒性作用的主要靶器官。

肾脏的结构及生理功能使其易受药物毒性成分的损害。肾脏损害主要表现为肾小球、肾小管损伤、导致肾缺血、间质性肾炎等。蒙药对肾脏可能造成的损害不容忽视，而瞿麦在体内排泄的过程中是否对肾脏有所损伤，尚无相关研究报道。且在临床上常用复方瞿麦治疗慢性肾炎，糖尿病肾病等肾脏疾病。那瞿麦在何种剂量之下可以对肾脏有保护作用，在何种剂量下对肾脏有毒性作用？本研究使用的瞿麦低剂量为0.25 g/ml，相当于成人临床剂量的5倍，已经造成肾脏的轻度损伤。尽管临床上不会用到实验剂量，但长期服用也许会通过积累导致肾脏的慢性损害。所以要注意严格控制临床长期使用瞿麦的剂量。因此，研究瞿麦是否会造成肾脏的损伤，具有重要的临床及理论研究意义。

OAT家族中的OAT1多表达在肾近曲小管上皮细胞基底膜侧[17]；OAT3在肾近曲小管和肾小管各部位基底膜侧都有表达。众多内、外源性有机阴离子型化合物在肾小管处的分泌和重吸收，均是由它们介导的；是帮助哺乳动物排泄体内毒性物质的重要转运体[18]，其对药物的代谢作用有不可替代的位置[19]。而OAT1和OAT3在肾脏中表达的下调，可能导致肾脏产生炎症，从而减少肾脏对毒性物质的分泌排泄和增加有机阴离子的积累[20-21]。本实验中通过 mRNA分子水平的检验证实了瞿麦（0.25、0.50、2.50 g/ml）给药7 d后，产生肾脏毒性损害时，OAT1和OAT3在肾脏组织内的表达量降低，肾脏病理切片结果也显示肾脏出现大面积的炎症浸润；可见瞿麦有抑制肾小管上OAT的作用，直接导致肾脏毒性物质的积累，可能是瞿麦导致肾脏毒性作用的主要机制之一。

因此，为了确保民族医药的用药安全，为患者的健康提供保障，迫切需要对中药、蒙药进行毒理研究，从而为寻找靶器官，解决蒙药肾、肝等主要脏器损害的途径和方法提供科学依据。