吴茱萸碱对DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎的保护作用研究

杨 哲，孙荣蔚，王赛男，杨 杰,2，王志刚,2，蔡雪婷,2*，曹 鹏,2**

(1.南京中医药大学，江苏 南京210023； 2.江苏省中医药研究院，江苏 南京210028)

吴茱萸(Tetradium ruticarpum(A.Jussieu)T.G.Hartley)是芸香科、吴茱萸属植物。吴茱萸始载于《神农本草经》。吴茱萸性热味苦、辛，有小毒，有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻之功，用于治疗肝胃虚寒、阴浊上逆所致的头痛或胃脘疼痛等症[1]。吴茱萸碱(Evodiamine，Evo)是吴茱萸的主要生物碱活性成分，现代药理学研究表明其具有抗炎，抗肿瘤作用[2]。作为传统中药中的瑰宝，充分探究吴茱萸的有效成分及药理作用，对其深度开发及合理使用尤为重要。

前期研究表明，吴茱萸碱对于氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸钠(Dxtran sodium sulfate，DSS)诱导的小鼠炎症性相关结直肠癌(Colitis-associated cancer，CAC)具有显著的预防作用[3]。CAC的发生与溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)密切相关，长期炎症刺激致使UC患者出现肠道不典型增生及癌症的风险明显高于常人[4]。UC发病多为急性转为慢性结肠炎，吴茱萸碱是否在结肠炎急性发病阶段就会对肠道产生化学预防及保护作用尚未明确，本研究即通过DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型探究吴茱萸碱对其的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

吴茱萸碱购自西安凯萌生物技术股份有限公司，葡聚糖硫酸钠(36-50 kDa)购自MPbio公司(货号0216011090，批号M8667)；小鼠TNF-α ELISA试剂盒(货号EK282/3)、IL-10 ELISA试剂盒(货号EK210/4)、TGF-β1 ELISA试剂盒(货号EK981)、IL-6 ELISA试剂盒(货号EK206/3)、IL-1β ELISA试剂盒(货号EK201B/3)均购自杭州联科生物技术股份有限公司；髓过氧化物酶检测试剂盒(货号EK0943)购自武汉博士德生物工程有限公司；总一氧化氮检测试剂盒(货号S0024)、丙二醛检测试剂盒(货号S0131S)、总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(货号S0101S)、Western及IP细胞裂解液(货号P0013)、细胞与组织裂解液(一氧化氮检测用，货号S3090)购自上海碧云天生物技术有限公司；H&E染液(货号G1005)、糖原染色套装(货号G1008)、苏木素染液(货号G1004)、分化液(货号G1005-3)、返蓝液(货号G1005-4)均购自Servicebio；Anti-Oxoguanine 8 antibody(货号ab206461)、Anti-Nitrotyrosine antibody(货号ab125106)购自Abcam公司。

1.2 仪器

全自动样品冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；低温高速离心机(Eppendorf公司)；全波长酶标仪(Thermo公司)；-80℃冰箱(Haier公司)；涡旋仪(Scientific Industries公司)；脱水机、包埋机、冻台(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；正置光学显微镜及成像系统(日本尼康)。

1.3 试验动物

C57BL/6雄性小鼠40只，6周龄，初始体重20±2 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，合格证编号NO.20201008，生产许可证号SCXK(苏)2016-0010。小鼠用SPF级鼠普通维持颗粒饲料(仪征安立卯生物科技有限公司)饲喂，饲养于江苏省中医药研究院动物中心，使用许可证号SYXK(苏)2016-0018。动物试验方案由江苏省中医药研究院伦理委员会审核并批准。

1.4 DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型制备及动物分组给药

小鼠适应性饲养1周后，随机分为4组，即溶剂对照组，模型组，Evo高剂量组(20 mg·kg-1)，Evo低剂量组(10 mg·kg-1)，每组10只。采用连续7天自由饮用2.5%的DSS水溶液构建急性溃疡性结肠炎模型，Evo高低剂量组在造模前3天开始灌胃给予相应剂量的Evo(0.5% CMC-Na配制)，直至造模结束后3天。溶剂对照组及模型组每日灌胃相应体积的0.5% CMC-Na溶液。造模及分组给药如图1。

图1 Evo保护DSS诱导急性溃疡性结肠炎小鼠试验流程图Fig.1 Flow chart of Evo protect acute ulcerative colitis mice induced by DSS

1.5 疾病活动指数评分

在试验过程中，每天记录小鼠体重、饮食状态、精神状态、粪便特征和死亡率。根据小鼠的体重变化、粪便性质和便血进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分[5-6]。

表1 疾病活动指数评分标准Table 1 Disease activity index scoring standard

1.6 脾脏重量/结肠长度比值

试验结束后，眼眶取血收集血清并处死小鼠，取盲肠至肛门处整段结直肠，测量长度并拍照。对小鼠脾脏进行称重，计算脾脏重量/结肠长度比值。

1.7 肠组织病理学检查

1.7.1 结肠大体损伤评分

盲法对结肠进行观察并进行结肠大体损伤评分：0，结肠无损伤；1，充血水肿，无溃疡；2，有溃疡，但无明显炎症；3，有溃疡，但只有炎症；4，有2例以上溃疡或炎症，溃疡大小< 0.5 cm；5，有两个以上的溃疡或炎症，至少有一个溃疡或炎症部位> 0.5 cm[7]。

1.7.2 组织学评分

将新鲜的结直肠组织用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，然后依次脱蜡、水化，进行PAS及苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，H&E)、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，最后在光学显微镜下观察组织形态并拍摄。盲法观察并进行组织学评分：0，正常结肠组织；1，炎症或溃疡病变仅出现在粘膜层；2，炎症或溃疡病变仅出现在粘膜下层；3，炎症或溃疡深部病变；4，对固有肌层、炎症或溃疡渗透性病变；5，炎症或壁通透性大的溃疡并有明显的穿孔[8]。

1.8 血清一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量测定

取各组小鼠等量结肠组织，用细胞与组织裂解液(NO检测用)进行裂解，按照总NO检测试剂盒说明书，采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，然后通过Griess reagent检测亚硝酸盐，540 nm处通过吸光度测定样品中总NO含量。

1.9 结肠组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量测定

取各组小鼠等量结肠组织，按照WST8法总SOD活性检测试剂盒说明书进行操作，通过样品对WST-8产物在450 nm下的吸光度计算样品中SOD酶活力。

1.10 结肠组织丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定

取各组小鼠等量结肠组织，用Western及IP细胞裂解液进行匀浆，匀浆后10000～12000×g离心10 min取上清，将上清各组样本按照TBA法试剂盒说明书检测MDA含量。通过单位重量的组织重量来表示最初样品中的MDA含量。

1.11 结肠组织髓过氧化物酶(Myelopearoxidase,MPO)和炎症因子含量测定

精密称取结肠组织，按照重量体积比依照不同试剂盒要求加入相应体积的匀浆介质，自动匀浆机进行匀浆(4℃，匀浆5 s停止2 s，共60个循环)，4℃，12000 r·min-1离心10 min取上清后，按照MPO和炎症因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA试剂盒说明书在相应吸光度下进行含量测定。

1.12 结肠组织中8-Oxoguanine(8-OHdG)、Nitrotyrosine的表达检测

通过对各组小鼠的结肠组织石蜡切片进行脱蜡至水后，置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复，3%双氧水溶液中室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加入不同的一抗进行4℃孵育过夜，后加入相同属种的二抗室温孵育50 min，洗涤后用二氨基联苯胺显色，苏木素复染3 min，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入75%酒精5 min，85%酒精5 min，无水乙醇5 min，新的无水乙醇再次5 min，二甲苯5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜下观察并采集图像，结果分析采用Image J 1.37v软件，每组随机抽取相同倍镜下的六个视野，通过阳性染色面积/总面积百分比半定量蛋白阳性的表达强度。

1.13 统计方法

2 结果

2.1 吴茱萸碱对急性结肠炎小鼠一般活动状况及DAI评分的影响

模型组小鼠在第5 d出现明显的精神不振，食欲及饮水量下降，耸背毛发竖立，第7 d出现明显的体重减轻并伴随着大便不成形，稀便，呆滞，不好动。随着DSS的持续摄入，体重仍持续下降，第8 d出现明显的血便，伴随死亡。试验结束后模型组死亡率高达40.0%，Evo低剂量组死亡率25.0%，Evo高剂量组死亡率只有16.7%。DSS组的DAI评分从开始DSS饮水2 d后即比溶剂对照组显著升高，体重显著下降，并持续整个试验过程(P<0.05)。Evo组可显著改善上述症状，DAI评分从第7 d开始较模型组显著下降(P<0.05)。

图2 DSS诱导的急性结肠炎模型中各组小鼠的DAI评分和体重变化Fig.2 Initial weight change and DAI score of each group in DSS-induced mice model of acute colitis.注A：各组小鼠体重变化；B：各组小鼠DAI评分变化。与溶剂对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，下同。

2.2 吴茱萸碱对急性结肠炎小鼠肠组织学的影响

2.2.1 脾脏重量/结肠长度比值及结肠大体损伤评分

脾脏肿大的临床意义为机体遭受炎症侵袭，急性溃疡性结肠炎结肠缩短也是重要的临床表现之一。因此，评价脾脏重量/结肠长度值可以直观的表现出机体的炎症程度及Evo对急性溃疡性结肠炎的改善作用[9]。图3A展示了各组小鼠典型结肠和脾脏形态，溶剂对照组小鼠结肠肠壁完整，纹理清晰，黏膜完整且光滑富有弹性；模型组小鼠结肠通体充血水肿，肠壁明显增厚，质地硬且弹性变差，具有明显的溃疡，盲肠明显缩小，与溶剂对照组和Evo组相比长度明显缩短。Evo治疗后可明显降低DSS所造成的结肠长度缩短及溃疡水肿现象的出现，通过结肠大体损伤评分(图3C)可以看出Evo对于急性溃疡性结肠炎有显著改善作用。与模型组相比，Evo给药组脾脏重量/结肠长度值明显降低(Evo 10 mg·kg-1vs 模型组，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型组，P<0.001)，其中Evo 20 mg·kg-1组对结肠炎小鼠的结肠保护作用尤为突出(图3B)。

2.2.2 PAS、H&E染色及结肠组织学评分

通过对结肠进行H&E染色(图4A)和组织学评分可知(图4B)，溶剂对照组小鼠结肠组织黏膜上皮细胞排列整齐，形态完整，腺体排列整齐，有明显的正常隐窝结构，杯状细胞结构完整数量丰富，黏膜各层无炎性细胞浸润；模型组小鼠结肠出现严重的炎症反应，黏膜各层均有溃破及坏死，大量的中性粒细胞及单核细胞等炎性细胞浸润，累积至肌层及浆膜，隐窝结构缺失，出现空泡状，腺体破损，杯状细胞数量明显减少。而经Evo干预后，可以明显减轻炎症所造成的结肠组织的损伤，Evo 20 mg·kg-1组表现出显著的炎症抑制及结肠保护作用，结肠组织可见完整的上皮细胞排列，隐窝结构及杯状细胞较模型组相比明显增多，且结构完整，炎症细胞浸润减轻。

图3 Evo对急性结肠炎小鼠结肠的保护作用Fig.3 Protective effect of Evo on colon of mice with acute colitis.注A：各组小鼠典型结肠和脾脏形态；B：各组小鼠脾脏重量/结肠长度值 (n=6)；C：盲法对各组结肠组织进行肉眼观察并根据评分标准进行结肠大体损伤评分(n=6)。

图4 不同倍镜下各组小鼠结肠组织H&E染色及组织学评分Fig.4 H&E staining of colon tissues of mice in each group under different magnification and histological score by blinded.注:A：各组小鼠结肠组织H&E染色；B：组织学评分(n=6)。

采用PAS染色法对中性粘蛋白进行染色，可以间接反映出肠道组织杯状细胞的数量。如图5所示，紫红色颗粒为杯状细胞所分泌的中性粘多糖，溶剂对照组及Evo各组呈现强阳性，而模型组近乎没有阳性染色，直观的说明了各组结肠组织杯状细胞的数量，证实了Evo对于DSS所诱导的溃疡性结肠炎的肠道保护作用。

图 5 各组小鼠结肠组织PAS染色(×50)Fig.5 PAS staining of colon tissues of mice in each group

2.3 吴茱萸碱对急性结肠炎小鼠氧化水平的影响

2.3.1 吴茱萸碱对血清NO含量的影响

临床研究表明，NO在结肠炎患者体内合成异常，NO合成增加，诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增高，iNOS活性增加与结肠炎患者炎性程度呈平行关系。同时，iNOS活性增高，导致致癌物质亚硝酸盐合成增多，是结肠炎患者诱发结肠癌的重要原因之一[10]。过量的NO合成，释放至组织，导致组织细胞损伤。因此，通过评价各组小鼠血清中NO含量，可全面评估Evo对于结肠炎的改善作用。如图6A所示，与溶剂对照组相比，模型组血清中NO含量增加(P<0.05)，经Evo干预后，Evo 20 mg·kg-1组小鼠NO含量显著降低(P<0.01)。

2.3.2 吴茱萸碱对结肠组织MDA、MPO和SOD含量的影响

通过对结肠组织中MDA、SOD、MPO进行含量测定(图6B-D)，模型组与溶剂对照组相比，MDA、MPO含量明显增加，SOD含量显著降低(P<0.001)。Evo给药组与模型组相比，MDA和MPO含量降低，SOD含量显著增加(MDA：Evo 10 mg·kg-1vs 模型组，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型组，P<0.01；MPO：Evo 20 mg·kg-1vs模型组，P<0.05；SOD：Evo 20 mg·kg-1vs模型组，P<0.05)。

图6 Evo对DSS诱导急性结肠炎小鼠结肠组织中氧化应激及血清中NO含量的影响Fig.6 Effects of Evo on oxidative stress in colon tissue and NO content in serum of DSS-induced acute colitis mice

2.3.3 吴茱萸碱对结肠组织中氧化损伤产物Nitrotyrosine和8-OHdG的影响

通过对各组小鼠结肠组织中Nitrotyrosine、8-OHdG进行免疫组化分析，评估机体氧化应激水平。通过图7可以看出，模型组小鼠与溶剂对照组相比，Nitrotyrosine、8-OHdG阳性表达明显增加(P<0.001)，经Evo各剂量组干预后，阳性表达明显减少，其中高剂量组保护治疗效果较低剂量组明显。

图7 Evo对结肠组织中8-OHdG、Nitrotyrosine阳性表达的影响Fig.7 The effect of Evo on 8-OHdG and Nitrotyrosine positive expression in colon tissue注A：结肠组织8-OHdG免疫组化分析代表性切片(×200)，棕黄色为阳性染色(红色指示为典型阳性表达)；B：8-OHdG 阳性表达统计结果(n=6)。C：结肠组织Nitrotyrosine免疫组化分析代表性切片(x200)，棕黄色为阳性染色(红色指示为典型阳性表达)；D：Nitrotyrosine阳性表达统计结果(n=6)。

2.4 吴茱萸碱对急性结肠炎小鼠炎症水平的影响

通过对结肠组织中抗炎因子TGF-β1、IL-10以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量进行测定，评价Evo对于急性溃疡性结肠炎的炎症调节作用。模型组与溶剂对照组相比，抗炎因子TGF-β1、IL-10含量明显降低(P<0.01)。促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显增高(TNF-α：P<0.01；IL-1β：P<0.001；IL-6：P<0.001)。而经过Evo干预后的小鼠结肠组织中，促炎因子含量明显下降，同时抗炎因子含量明显升高，差异具有统计学意义(见图8)。

图8 Evo对小鼠结肠组织中炎性因子表达的影响Fig.8 Effects of Evo on the expression of inflammatory factors in the colon tissue of mice

3 讨论

以往研究炎症性相关结直肠癌多通过慢性结肠炎模型进行验证，相较于慢性结肠炎，急性结肠炎发病程度重，发病率高，是慢性结肠炎的必经阶段。本研究通过急性结肠炎模型组小鼠相关指标进行测定，发现肠道上皮完整性破坏，氧化应激及损伤严重，这些都与炎症引起的结直肠癌变密切相关。因此，对于炎症性相关结直肠癌的化学预防，不能仅针对于慢性炎症阶段，在结肠炎急性阶段，有效的去预防及干预治疗尤为重要。

本次试验首次证明吴茱萸碱在溃疡性结肠炎急性阶段就可以起到显著的保护治疗作用，降低氧化应激，抑制炎症及炎症所造成的细胞癌变。我们通过在DSS造模过程中及造模前3 d和后3 d给予Evo干预，通过对小鼠体重的变化、粪便性状及便血情况进行DAI评分，用以衡量急性结肠炎疾病的进程。脾脏肿大的临床意义为机体遭受炎症侵袭，急性溃疡性结肠炎结肠缩短也是重要的临床表现之一。因此，评价脾脏重量/结肠长度值可以直观地表现出机体的炎症程度及Evo对急性溃疡性结肠炎的预防治疗作用[5]。我们通过评估各组小鼠脾脏重量/结肠长度值之间的差异，发现模型组小鼠结肠长度明显缩短，脾脏变大且呈现暗红色；而溶剂对照组及Evo各组小鼠脾脏重量/结肠长度值均小于模型组，脾脏大小正常，颜色鲜艳。

杯状细胞是粘蛋白的主要来源，在肠道的保护因素中起到决定性的作用。正常情况下，杯状细胞呈现锥状体结构，向胞外分泌富含粘蛋白的粘液颗粒，与水混合后形成粘液，附着于肠粘膜的表面，构成一层膜状保护结构。因此，杯状细胞的数量多少和形态可以反映出肠粘膜的健康状况[11]。通过PAS染色法对杯状细胞进行染色，发现Evo对于肠道的有效保护及炎症预防作用。

多数研究认为，结肠炎的发生及恶化与氧化应激及NO代谢异常密切相关。在正常情况下，肠道活性氧(Reactive oxygen species，ROS)具有杀菌作用，参与肠道防御功能。然而，过度ROS产生，超过在宿主抗氧化防御的缓冲能力所衍生的氧化应激会导致脂质过氧化，肠黏膜屏障损伤，细菌移位和炎症反应[12]。MDA是脂质过氧化的最终产物，被认为是氧化应激下的有害产物，导致组织和器官损伤；MPO是一种在单核细胞和巨噬细胞中表达中性粒细胞和低血小板的酶，MPO活性增强是中性粒细胞浸润和炎症的一个重要指标；在氢离子与超氧化物发生反应生成过氧化氢和氧的过程中，SOD充当催化酶作用，减少过渡金属通过产生自由基引发及氧化应激损伤[13]；临床研究表明，NO在结肠炎患者体内合成异常，NO合成增加，iNOS活性增高，iNOS活性增加与结肠炎患者炎性程度呈平行关系。同时，iNOS活性增高，导致致癌物质亚硝酸盐合成增多，是结肠炎患者诱发结肠癌的重要原因之一[14]。8-OHdG作为ROS引起DNA氧化损伤的修饰产物之一，外界炎症刺激导致机体产生大量的ROS直接攻击DNA中鸟嘌呤，使得脱氧鸟苷氧化为8-OhdG。因此，机体8-OHdG的含量可以间接反应机体的氧化损伤程度，是目前公认的衡量机体氧化应激及DNA氧化损伤的高效指标[14-15]。氧化应激对蛋白质损伤的一个重要标志物是硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)。Nitrotyrosine是自由基与蛋白质中的酪氨酸残基相互作用的产物，当炎症侵袭时，炎性介质与蛋白质酪氨酸残基或酪氨酸发生硝化反应，酪氨酸硝基化一方面可以反应机体炎症及氧化应激水平，同时会使体内多种有重要功能的酶和蛋白功能受损[15]。因此，我们验证了经Evo给药后血清中NO及结肠组织中MDA、MPO、SOD的含量，免疫组化法测定了结肠组织中8-OHdG及Nitrotyrosine的表达，明确表明Evo可以降低机体氧化应激程度，减少NO的产生，从而减少结肠损伤及诱发结肠癌变。

炎症因子及抗炎因子在结肠组织中的含量可以最为直观的体现机体遭受炎症反应的程度。同时，炎症刺激导致肿瘤的发生主要与各种炎症因子及其炎症因子所参与的相关通路有关，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子对肿瘤基因、表观遗传学、各种信号通路均有影响[16-17]。本试验通过ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎因子TGF-β1、IL-10含量，结果表明Evo可以明显的降低相关炎症因子的表达并升高抗炎因子的水平。

综上所述，吴茱萸碱具有改善急性溃疡性结肠炎的作用，并可显著抑制急性肠炎模型小鼠肠道高氧化应激和高炎症状态。本研究可为进一步探讨吴茱萸碱预防或治疗UC、CAC的机理提供研究基础。