蒺藜皂苷通过调控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表达抑制结肠癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡

刘经州，杨红群，宋春侠

（1.承德医学院附属医院，河北承德 067000；2.承德市妇幼保健院，河北承德 067000）

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，传统的手术、化疗等方法治疗结肠癌存在一定的局限性，而中医药治疗结肠癌有其独特优势［1］。因此，研发新的中医药对治疗结肠癌及提高其疗效具有重要意义。蒺藜Tribulus terrestris L.是蒺藜科植物蒺藜属植物，传统中药之一，蒺藜皂苷是从蒺藜中提取出的主要活性成分之一，其具有抗癌、治疗心血管疾病的作用［2］。研究报道蒺藜皂苷能通过影响细胞周期及诱导细胞凋亡抑制卵巢癌细胞的增殖［3］。蒺藜总螺甾皂苷能抑制人卵巢透明细胞癌荷瘤裸鼠肿瘤作用［4］。蒺藜的皂苷提取物可诱导人乳腺癌MCF-7 细胞导凋亡［5］。但蒺藜皂苷对结肠癌增殖、凋亡的影响及其机制还尚不清楚。研究报道lncRNA AGAP2-AS1 在结直肠癌组织和细胞中上调表达，促进结直肠癌细胞的增殖［6］。沉默AGAP2-AS1 可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭，同时增强细胞的凋亡［7］。miR-646 在结直肠癌组织和细胞系中下调表达，高表达miR-646 可抑制结直肠癌细胞增殖和迁移［8］。因此，本实验旨在研究蒺藜皂苷对结肠癌增殖、凋亡的影响及其机制是否与lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 有关。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌细胞株HCT116（上海冠导生物工程有限公司，批号C00135507）；DMEM 培养基（美国Sigma 公司，货号EY-4648）；蒺藜皂苷（纯度≥98%，上海同田生物技术股份有限公司，货号E-3190）；四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）试剂盒（德国IBL公司，货号JKSJ—1812）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素／碘化丙锭（Annexin V-Fluorescein isothiocyanate／propidium iodide，Annexin V-FITC／PI）凋亡检测试剂盒（日本同仁研究所，货号AD10-2）；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（上海研谨生物科技有限公司，货号YPA101-01）；一步法荧光定量PCR 试剂盒（美国GENMED 公司，货号GMS12113）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号KFS303-ZPR）。

1.2 细胞处理与分组 结肠癌细胞株HCT116 用含10% 胎牛血清的DMEM 培养液在37 ℃、5%CO2孵育箱中培养，取对数生长期细胞HCT116，分别用20、40、80 mg／L 的蒺藜皂苷处理作为蒺藜皂苷低、中、高剂量组，不做任何处理的细胞作为对照组。

取生长状态良好且密度达到80% 左右的HCT116 细胞进行转染，分别将10 μg 的AGAP2-AS1 过表达对照质粒（pcDNA）、AGAP2-AS1 过表达质粒（pcDNA-AGAP2-AS1）、AGAP2-AS1 抑制表达对照质粒（si-NC）、AGAP2-AS1 抑制表达质粒（si-AGAP2-AS1）、miR-646 模拟物对照质粒（miR-NC）、miR-646 模拟物（miR-646）分别加入100 μL 不含血清的培养液；将50 μg 脂质体也用不含血清的培养液稀释至100 μL；将上述2 种溶液轻轻混合在一起，室温静置10 min，将上述混合物小心加入到培养皿中，分散均匀，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养；分别记为pcDNA 组、pcDNA-AGAP2-AS1 组、si-NC 组、si-AGAP2-AS1组、miR-NC 组、miR-646 组。

将pcDNA、pcDNA-AGAP2-AS1 按上述方法转染至细胞HCT116 中再用80 mg／L 的蒺藜皂苷处理，记为蒺藜皂苷+pcDNA 组、蒺藜皂苷+pcDNAAGAP2-AS1 组。

1.3 MTT 检测细胞增殖抑制率 各组细胞培养至48 h 时，每孔分别加入20 μL 的MTT 溶液，于培养箱中继续孵育4 h 后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡反应10 min 使沉淀溶解，用酶标仪于波长490 nm 处检测吸光度（OD）值。细胞增殖抑制率＝1-OD 值实验组／OD值空白对照组×100%。实验重复3 次。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS 漂洗2 次，与500 μL 的结合缓冲液混匀。先加入10 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3 个复孔，实验重复3 次。

1.5 Western blot 法检测蛋白表达 各组细胞培养48 h 后提取总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室温孵育90 min，TBST 洗涤，用ECL 发光液显影，成像后用Quantity One 软件检测蛋白条带灰度值，蛋白相对表达＝目的条带灰度值／GAPDH 条带灰度值。每个蛋白样品设3 个重复。

1.6 RT-qPCR 检测lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 的表达 各组细胞培养48 h，提取总RNA，反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3 个重复，循环条件为95 ℃3 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。lncRNA AGAP2-AS1 和 miR-646 分别以GAPDH和U6 为内参，lncRNA AGAP2-AS1 正向引物序列5′-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3′，反向引物 序 列5′-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3′；GAPDH 正向引物序列5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物序列 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-646 正向引物序列5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3′，反向引物序列5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGG CCTCAGA-3′；U6 正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 荧光素酶报告实验检测lncRNA AGAP2-AS1对miR-646 的靶向调控 构建含miR-646 结合位点的野生型和突变型基因靶点lncRNA AGAP2-AS1 的荧光素酶表达载体 WT-AGAP2-AS1 和 MUTAGAP2-AS1，将其分别与miR-NC 和miR-646 共转染至HCT116 细胞中。按照说明书检测荧光素酶活性，实验重复3 次。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，2 组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，蒺藜皂苷低、中、高剂量组HCT116 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及p21、Bax表达升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），并呈浓度依赖性，见图1、表1。

图1 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响Fig.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

表1 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表1 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与蒺藜皂苷低剂量组比较，＃P＜0.05；与蒺藜皂苷中剂量组比较，△P＜0.05。

2.2 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞中lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 表达的影响 与对照组比较，蒺藜皂苷低、中、高剂量组HCT116 细胞中lncRNA AGAP2-AS1 表达降低（P ＜0.05），miR-646 表达升高，并呈浓度依赖性（P ＜0.05），见表2。

表2 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞中lncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表达的影响（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表2 蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞中lncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表达的影响（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与蒺藜皂苷低剂量组比较，＃P＜0.05；与蒺藜皂苷中剂量组比较，△P＜0.05。

2.3 lncRNA AGAP2-AS1 靶向调控miR-646 表达 LncBase Predicted v.2 预测显示，AGAP2-AS1与miR-646 存在结合位点，见图2。荧光素酶报告实验显示，与miR-NC 组比较，miR-646 组中转染WT-AGAP2-AS1 的细胞荧光素酶活性降低（P ＜0.05），而转染MUT-AGAP2-AS1 的细胞荧光素酶活性无显著差异，见表3。与pcDNA 组比较，pcDNA-AGAP2-AS1 组miR-646 表达降低（P ＜0.05）；与si-NC 组比较，si-AGAP2-AS1 组miR-646 表达升高（P＜0.05），见表4。

图2 AGAP2-AS1 的序列中含有与miR-646 互补的核苷酸序列Fig.2 AGAP2-AS1 sequence containing a nucleotide sequence complementary to miR-646

表3 双荧光素酶报告实验结果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

表3 双荧光素酶报告实验结果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

注：与miR-NC 组比较，∗P＜0.05。

表4 lncRNA AGAP2-AS1 调控miR-646 表达（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

表4 lncRNA AGAP2-AS1 调控miR-646 表达（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

注：与pcDNA 组比较，∗P＜0.05；与si-NC 组比较，＃P＜0.05。

2.4 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC 组比较，si-AGAP2-AS1 组HCT116 细胞AGAP2-AS1 表达及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及p21、Bax 表达升高（P＜0.05），见图3、表5。

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：与si-NC 组比较，∗P＜0.05。

2.5 miR-646 过表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC 组比较，miR-646 组HCT116 细胞中miR-646 表达、细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及p21、Bax 表达升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05），见图4、表6。

图3 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响Fig.3 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

图4 miR-646 过表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响Fig.4 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

表6 miR-646 过表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表6 miR-646 过表达对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的影响（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：与miR-NC 组比较，∗P＜0.05。

2.6 lncRNA AGAP2-AS1 过表达逆转了蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的作用 与蒺藜皂苷+pcDNA 组比较，蒺藜皂苷+pcDNA-AGAP2-AS1 组 HCT116 细胞中 AGAP2-AS1 表达及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达升高（P ＜0.05），miR-646 表达、细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及p21、Bax 表达降低（P＜0.05），见图5、表7。

表7 lncRNA AGAP2-AS1 过表达逆转了蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表7 lncRNA AGAP2-AS1 过表达逆转了蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与蒺藜皂苷+pcDNA 组比较，＃P＜0.05。

3 讨论

图5 lncRNA AGAP2-AS1 过表达逆转了蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

细胞增殖和凋亡失衡是导致肿瘤发生的原因之一，寻找高效低毒的抗肿瘤药物是肿瘤治疗的研究热点，而中药天然活性成分逐渐成为现代抗肿瘤药物开发的新趋势［9］。蒺藜皂苷是中药蒺藜的主要活性成分之一，研究表明蒺藜皂苷提取物可影响乳腺癌细胞的凋亡和转移［10］。蒺藜皂苷D 在体外和体内可抑制人前列腺癌的生长和血管生成［11］。为研究蒺藜皂苷对结肠癌增殖、凋亡的影响，本实验用不同浓度的蒺藜皂苷处理结肠癌HCT116 细胞，结果显示，细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率升高，细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B 细胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2）蛋白表达降低，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，p21）、Bcl-2 相关X（Bcl-2 associated X，Bax）表达升高，并呈浓度依赖性。表明蒺藜皂苷可剂量依赖的抑制结肠癌HCT116 细胞增殖、促进细胞凋亡。

研究报道miR-646 在胃癌组织中低表达，上调其表达抑制胃癌细胞的增殖和转移［12］。过表达miR-646 可抑制肺癌A549 细胞的增殖、迁移及侵袭能力［13］。以上研究结果表明miR-646 在多种肿瘤中可能起抑癌作用。本实验过表达miR-646 后可抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。有研究报道lncRNA ZFAS1 可通过下调miR-646 促进骨肉瘤细胞的生长，迁移和侵袭［14］。

研究报道AGAP2-AS1 可促进肝细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制细胞凋亡［15］。AGAP2-AS1 上调还可促进胰腺癌细胞增殖和迁移［16］。沉默AGAP2-AS1 抑制食道癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡［17］。本实验结果显示，抑制lncRNA AGAP2-AS1 表达，细胞增殖抑制率升高，细胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达降低，p21、Bax 表达升高。表明抑制lncRNA AGAP2-AS1表达可抑制结肠癌HCT116 细胞增殖、促进细胞凋亡。且本实验还发现，AGAP2-AS1 靶向调控miR-646。蒺藜皂苷处理后结肠癌HCT116 细胞中AGAP2-AS1 表达降低，miR-646 表达升高；且lncRNA AGAP2-AS1 过表达逆转了蒺藜皂苷对结肠癌HCT116 细胞增殖和凋亡的作用。表明蒺藜皂苷可能通过下调抑制结肠癌HCT116 细胞增殖、促进细胞凋亡。

综上所述，蒺藜皂苷可通过调控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表达抑制结肠癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡。