实时荧光定量PCR 法用于流感病毒检测的效果分析

于子洛

流感是一种高发于冬春季的急性呼吸道疾病,具有极强的传染性,若不及时对患者进行诊治则可能造成大规模传染,引发严重公共卫生事件。一般流感是由流感病毒感染所致,但因其临床表现与普通感冒相似,导致在前期检测诊断时容易发生误诊或漏诊的情况,不利于后期相关的防治。张群等［1］团队通过研究发现,可将实时荧光定量PCR 法应用于流感的检测诊断,并在研究结果中表明该方法不仅具有较高的检出率,同时还能有效分析其特异度等指标,为后期诊疗提供更多有利信息［2］。为验证上述论点,本次研究将实时荧光定量PCR 法用于流感病毒的检测,并通过对比方式分析该检验方式的应用价值,研究的方法及结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院于2019 年3 月～2020 年3 月收治的250例疑似流感患者,其中男137例,女113例；年龄16～83 岁,平均年龄(38.14±16.35)岁。纳入标准：①患者体温均在38～41℃；②患者均伴随咳嗽、咽痛等临床症状［3］；③患者均知晓本次研究内容并签署知情同意书。本次临床研究符合赫尔辛基宣言,并已通过医院伦理委员会审核并批准。排除标准：①合并严重心脑血管疾病,肝肾等脏器功能不足、恶性肿瘤患者；②合并其他传染性疾病患者；③存在严重精神病症,依从性低的患者；④一般资料不全或中途退出者。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 力新HFsafe1200 生物安全柜(BSC-1100IIB2-X1 济南鑫贝西生物技术有限公司)、核酸提取仪［美国Applied Biosystems 公司(中科拜尔)］、MDF-382EN 三洋(美菱)超低温冰箱、5415R 高速冷冻离心机(由德国Eppendrof 公司)、荧光定量PCR 扩增仪(美国life 公司)、核酸提取试剂盒(中科拜尔)。

1.2.2 标本采集 对患者进行咽拭子采集,每例患者均采取3 ml 标本,共采集2 次,并于24 h 内进行送检,样本留置时间不宜过长。

1.2.3 病毒分离培养法 将采集的标本进行分离、接种,再根据类型进行分类,根据每瓶25 ml 的比例接种标本,每份标本接种3 份,于接种后2 d 观察标本是否存在细胞病毒病变,若当标本内细胞有80%以上受到病毒感染或对内细胞连续培养7 d 后提取细胞,应用豚鼠血展开血凝实验,当血凝滴度数值＜1∶8 或阴性培养物在后代培养均为阴性,则可以呈阴性标本,并将流感病毒进行分型。

1.2.4 实时荧光定量PCR 法 依照试剂盒说明提取RNA 及配置反应体系,在进行实时荧光定量PCR 法时对阳性及阴性进行对比,该反应流程包括：根据5 个循环分别将时间和环境温度设置为：第1 循环：50℃,培养30 min；第2 循环：95℃,培养3 min；第3 循环：95℃,培养15 s；第4 循环：50℃,培养30 min；第5 循环：72℃,培养1 min；于10 s 设定95℃、40 s 设定55℃为40 个循环。其中将羧基荧光素(FAM)设定为荧光素,当在55℃时进行荧光信号的收集。

1.3 观察指标 以细胞培养法检测结果作为金标准,对比病毒分离培养法和实时荧光定量PCR 法检测的阳性检出率、灵敏度、特异度及准确率。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法阳性检出率对比 细胞培养法检测检出140例阳性标本,110例阴性标本；病毒分离培养法检出59例阳性标本,191例阴性标本,阳性检出率为23.60%；实时荧光定量PCR 法检出93例阳性标本,157例阴性标本,阳性检出率为37.20%。实时荧光定量PCR 法阳性检出率高于病毒分离培养法,差异有统计学意义(χ2=10.927,P=0.001＜0.05)。

2.2 两种检测方法灵敏度、特异度及准确率对比 实时荧光定量PCR 法的灵敏度62.14%、特异度94.55%及准确率76.40%均高于病毒分离培养法的31.43%、86.36%、55.60%,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两种检测方法灵敏度、特异度及准确率对比(%,n=250)

3 讨论

由于流感临床症状表现与普通感冒临床症状差异不明显,故在前期诊断时易发生误诊甚至漏诊情况,进而影响后期相关诊疗。当前有关实验室流感病毒诊断最常用的方式为病毒分离培养法及鉴定病毒。通过将采集自流感患者的咽拭子作为标本,对该标本内的细胞进行培养,并取受到感染的细胞进行分离,将病毒进行分型［4-6］。通过该诊断方式能够确保流感病毒的抗原性,并使原始标本处于一致的状态,这有利于对标本的长时间保存,可更准确的分析病毒抗原性及其基因。虽然该方法具有较高的临床诊断价值,但病毒培养难度较大,同时还需保证标本品质高,载量足,若无法满足上述要求,则容易在对病毒进行鉴定时出现假阴性或假阳性的情况,同时应用该方法分离出的病毒无法作为后期诊疗过程中的参照物,因此采取该检测方法需要在收集、保存标本的过程中确保病毒的活性［7］。本次研究将实时荧光定量PCR 法应用于流感病毒的检测中,该方法近年来被广泛应用于多种病毒入侵致感染的检测和诊断中,在病毒性传染病的快速诊断、病毒分型、不同病毒的鉴别检测、耐药突变体检测、新发传染病病原体快速检测等方面发挥着重要作用［8］。通过同时检测4种荧光信号实现荧光定量PCR 法对不同分型流感病毒进行分型,对PCR 扩增反应中的每一个循环产物的荧光信号进行实时检测,实现在该过程中定量以及定性分析起始模板到最后一个信号的收集,实时荧光定量PCR 反应产物都会不断增多,荧光信号强度也会不断增强,每经过一个循环就会收集到一个荧光信号强度,从中可以根据荧光强度的变化观察产物量的变化状况,具有成本低、灵敏度高、特异度高、检测速度快、检测设备重量轻等特点,相较于病毒分离培养法不仅更能有效降低假阴性和假阳性的发生,同时在灵敏度、特异度以及准确性上表现更佳。本次研究结果显示,实时荧光定量PCR 法阳性检出率37.20%高于病毒分离培养法的23.60%,差异有统计学意义(P＜0.05)。实时荧光定量PCR 法的灵敏度62.14%、特异度94.55%及准确率76.40%均高于病毒分离培养法的31.43%、86.36%、55.60%,差异有统计学意义(P＜0.05)。上述结果与王宁红等［9］的研究结果较为一致。但需要注意,在开展实时荧光定量PCR 法检测需要在条件较高的实验室中实施,实验室要求配备特殊仪器,需要专业操作人员操作,因此想全方面开展该项技术还需经过长期发展［10］。

综上所述,相较于病毒分离培养法,通过实时荧光定量PCR 法检测流感病毒能更快更准确检测样本,具有较高的应用价值。