豆渣降解高温菌的筛选及应用

陈枭嘉,李 立，马新新,史吉平，赵志军

(1.中国科学院 上海高等研究院绿色化学工程研究中心，上海 201210；2.中国科学院大学，北京 100049； 3.上海科技大学 生命学院，上海 201210；4.上海清美绿色食品(集团)有限公司，上海 201300)

中国是豆制品消费的第一大国，2017年我国用于食品工业的大豆量约为1 200万t，豆渣是豆制品生产过程中的副产品，目前，国内每年产生约1 500万t豆渣[1]。豆渣虽然富含蛋白质、膳食纤维、脂肪、维生素等营养元素，但因其含水量大，极易腐败产生恶臭物质，进而对环境造成污染[2]。目前，豆渣主要应用于动物饲料和土壤有机肥生产，但由于豆渣含胰蛋白酶抑制因子、致甲状腺肿素、凝血素等多种抗营养因子，长期将其作为饲料，容易导致牲畜消化不良，从而影响生长[3]。为了避免豆渣引起的环境污染和实现豆渣的资源化利用，制备有机肥是经济有效的方法[4]。

传统发酵制备有机肥的温度较低(长期保持在50～60 ℃)，发酵周期为2～3个月，腐熟缓慢[5-6]。高温发酵制备有机肥是一种新型的好氧高温发酵生产有机肥技术，该技术在农业废弃物料中接入高温发酵菌剂，可以提高有机物料的降解速率，加速物料腐熟，进而提高有机肥制备效率[7-8]。如宋春等[9]采用高温发酵技术，将羊粪有机肥腐熟时间缩短了1/2。其次，高温发酵还能有效灭活有机废弃物中的病原菌[10-11]。据文献报道，在有机肥发酵过程中，只要温度超过70 ℃并且时间持续25 min以上，就可以灭活有机废弃物中的病原微生物[12]。此外，高温微生物在通气条件下还可以减少有机肥发酵过程中的甲烷和一氧化二氮等有害气体产生，实现环境友好生产有机肥[13]。

目前关于豆渣高温发酵制备有机肥的研究尚未见报道。鉴于豆渣物料本身缺乏高温菌，为能够让豆渣高温发酵制备有机肥顺利实施，主要从以下几个方面进行具体技术研究：从采集样品中筛选能在70 ℃以上生长的高温菌；从高温菌中筛选可高效利用豆渣生长的菌株；研究筛选菌株的增殖培养条件；模拟豆渣发酵制备有机肥的高温阶段(70 ℃)，考察高温菌株对豆渣发酵制备有机肥的影响。

1 材料和方法

1.1 豆渣高温菌的筛选

采集上海野生动物园的马粪样品、上海光明生猪养殖场的粪污样品、上海清美食品有限公司豆制品厂的豆渣样品以及上海奉贤生活污泥处理厂的生活污泥样品。将采集的新鲜样品各取5 g分别加入至100 mL CYS液体培养基[14]，并将锥形瓶放在70 ℃水浴摇床中富集培养24 h，转速为200 r/min。取上述培养后的液体进行稀释涂板，培养基为固体豆渣培养基，并将平板放在70 ℃培养箱中培养24 h。将平板上形态不同的单菌落分别接种至固态CYS培养基平板上进行二次划线培养和保藏。

固体豆渣培养基配方：将新鲜豆渣烘干后磨成粉，取50 g干豆渣、15 g琼脂粉，加蒸馏水定容至1 L，pH值自然。121 ℃高压灭菌20 min冷却至室温保存。

CYS培养基配方：胰蛋白胨 3 g、酵母粉2 g、可溶性淀粉1 g、NaCl 3 g、CaCl20.5 g、MgCl20.125 g、FeSO410 mg，微量元素液100 μL，加蒸馏水定容至1 L，用NaOH调节pH值至7.5，121 ℃高压灭菌20 min冷却至室温保存。其中，微量元素液配方：Na2MoO4·2H2O 12 g、VOSO41 g、MnCl25 g、ZnSO4·7H2O 0.6 g、CuSO4·5H2O 0.15 g、COCl2·6H2O 8 g、NiCl2·6H2O 0.2 g，加蒸馏水定容至1 L，pH值自然。

1.2 高温菌的16S rDNA鉴定

用无菌牙签分别采集豆渣培养基平板上的菌落，转接至50 μL生理盐水中，沸水浴中放置5 min后，离心取上清液，获得菌株基因组DNA的粗提液。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)进行扩增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。测序所得16S rDNA 序列与GenBank数据库中相关种属的序列进行比较，构建系统发育树。

1.3 降解豆渣高温菌的验证

将高温菌用摇瓶培养24 h后，通过离心机6 000 r/min离心5 min收集菌体。将湿豆渣通过烘干措施控制含水量约在70%，用NaOH调节pH值至7.5。取处理后的豆渣50 g加入250 mL锥形瓶中，各加入2 mL OD600=10 菌体溶液。空白组加入2 mL无菌水作对照。用透气封口膜把锥形瓶封上，放入70 ℃培养箱培养5 d，每天锥形瓶中的豆渣摇匀1次。记录豆渣前后质量和含水量的变化。以上试验均重复3次，通过豆渣降解率的指标考察，筛选豆渣高温降解菌。降解率公式如下:

(1)

其中:m0d和m5d分别代表豆渣初始质量(湿质量)和发酵5 d后的质量(湿质量)；w0d和w5d分别代表豆渣初始含水量和发酵5 d后的含水量。

1.4 豆渣降解菌的增殖培养条件优化

将筛选的豆渣降解菌的菌体收集，用无菌水调节OD600=1，将1 mL调节好的菌液加入含50 mL CYS 培养基(pH值7.5)的250 mL锥形瓶中，分别放入30、40、50、60、65、70、75、80 ℃水浴摇床中150 r/min培养12 h后，测OD600，考察不同温度下，豆渣降解菌在CYS 液体培养基中的增殖生长情况。

将1 mL调节好的菌液加入含50 mL CYS 培养基(pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的250 mL锥形瓶中，放入70 ℃水浴摇床中150 r/min培养12 h后，测OD600，考察不同初始pH值下，豆渣降解菌在CYS 液体培养基中的增殖生长情况。

将1 mL调节好的菌液加入含50 mL CYS 培养基(pH值7.5)的250 mL锥形瓶中，放入70 ℃水浴摇床中150 r/min分别培养4、8、12、16、20、24 h，测OD600，考察不同培养时间下，豆渣降解菌在CYS液体培养基中的增殖生长情况。

细菌生长特性以单位细菌OD600值在单位时间内增加量来表示。细菌的比生长速率μ计算公式如下：

(2)

其中：μ表示以细菌OD600值表示的比生长速率，单位h-1；X0代表细菌的初始OD600值；X代表细菌的OD600值；t代表细菌生长时间，单位h。

考察不同培养时间下豆渣降解菌在CYS液体培养基中的增殖生长情况。

以上试验均重复3次。

1.5 豆渣恒温高温发酵模拟

在实验室中模拟制作豆渣有机肥恒温高温发酵的小型发酵罐(图1)。将湿豆渣烘干至含水量约70%，调节豆渣pH值为7.5。将40 mL OD600=10 的豆渣降解高温菌的菌液接种至含1 000 g 豆渣(含5%黄浆水污泥)的发酵罐中，混合均匀。空白组(CK)则加入40 mL无菌水。发酵罐中温度控制70 ℃，通风量控制在0.5 L/min，模拟恒温高温有机肥发酵5 d。每天取30 g样品，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，并及时进行指标检测。以上试验均重复3次。样品基本理化性质如表1所示。

表1 样品基本理化指标Tab.1 Basic physical and chemical indexes of samples

1.6 测定方法

样品总有机碳(TOC)含量参照《HJ 615—2011土壤有机碳的测定 重铬酸钾氧化—分光光度法》进行测定；总氮(TN)含量参照《NY/T 2542—2014 肥料总氮含量的测定》进行测定；碳氮比(C/N)=有机碳含量/总氮含量；种子发芽指数(GI)测定参照国标GB/T 23486—2009附录A 并进行改进，采用10粒胡萝卜种子替代方法中的20粒小白菜种子进行。

含水量测定步骤如下，将新鲜样品放入105 ℃烘箱24 h，含水量计算如下：

(3)

其中：m0和m1分别为样品烘干前和烘干后质量，单位g。

磷、钾含量测定步骤如下：取0.1 g干物质加入2 mL浓硝酸和1 mL双氧水，在微波消解炉中120 ℃消解2 h，消解后用去离子水稀释至50 mL，并用离心机6 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液稀释至50 mL，过膜0.22 μm微孔滤膜。液体中的磷和钾含量用ICP光谱仪(PE avio 200)进行测定。

1.7 数据分析

采用 Microsoft Excel 2016 对数据进行统计及相关性分析，采用Origin 2020作图。

2 结果与分析

2.1 豆渣降解高温菌的筛选与鉴定

在采集的马粪、猪粪、豆渣以及生活污泥中，通过筛选获得7株可以利用豆渣生长的高温菌，其中 1、7号菌来源于马粪，4、5和6号菌来源于生活污泥，3号菌株来源于豆渣，2号菌株来源于猪粪。16S rDNA菌种鉴定结果表明，所测的1号、2号菌株核苷酸序列分别为1 593、1 019 bp。将所测序列在NCBI上进行BLAST查找相似的序列，构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树。如图2所示，1号和2号菌株与Geobacillustoebii的同源性很高。结合形态初步确定1号和2号菌株为Geobacillustoebii，并分别命名为G.T1和G.T2。

所测的3号菌株核苷酸序列为1 334 bp。3号菌株与Geobacillussp.亲缘关系较高，与Geobacillussp.strain NN-36的同源性为99.55%。结合形态初步确定3号菌株为Geobacillussp.，并将其命名为G.sp.70.L1。

所测的4号、5号菌株核苷酸序列分别为1 300、1 293 bp。4号和5号菌株与几株Methylobacteriumsp.的同源性很高。结合形态初步确定4号和5号菌株为Methylobacteriumsp.，并分别命名为M.sp.85.H4和M.sp.83.H10。

所测的6号、7号菌株核苷酸序列分别为1 338、1 304 bp。6号和7号菌株与Thermusthermophilus的同源性很高。结合形态初步确定6号和7号菌株为Thermusthermophilus，并分别命名为The.t.83.H7和The.t.80.FJMF2。

2.2 豆渣降解高温菌的验证

微生物的代谢活动会导致有机物发生不同程度的降解，因此，通过农业废弃物干物质的减少量可以间接反映微生物在该条件下的生长情况。如图3所示，在70 ℃条件下发酵5 d后，接种不同高温菌株的豆渣呈现出不同程度的降解率。其中，加入G.T1菌株后，豆渣降解效果最为明显，干物质的降解率达到4.80%。其次是菌株G.T2和菌株M.sp.85.H4，其对应豆渣干物质降解率分别为1.34%和1.26%，其他4株菌株接种的豆渣，其干物质降解率均低于0.2%。根据文献[15]报道，在70 ℃以上时，Geobacillustoebii分泌的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶仍可维持高活性，因此，在70 ℃条件下，Geobacillustoebii可有效降解豆渣。然而，值得注意的是，尽管G.T1和G.T2 两个株菌均从属于Geobacillustoebii，但是降解效果差别很大，G.T1菌株对应豆渣的降解率是G.T2的3.6倍。这可能与2株菌株的来源环境不同相关，G.T1来自马粪样品，生长环境的纤维含量较高，使得G.T1菌株在纤维含量同样较高的豆渣中生长代谢更加旺盛，适应性更强；而来源于猪粪的G.T2，因缺乏高纤维含量的环境驯化，其在豆渣中的代谢活动较弱。因此，本研究选择最佳豆渣降解菌株G.T1作为进一步研究的对象。

2.3 豆渣降解高温菌株G.T1的增殖培养条件优化

微生物的增殖培养是其接种至有机废弃物中进行发酵制备有机肥的必要条件。本研究分别从培养温度、物料初始pH值和培养时间3个因素考察高温菌株G.T1的增殖培养条件。如图4a所示，在培养温度40～75 ℃内，菌株G.T1的最适生长温度为65 ℃，其生长曲线与Geobacillustoebii的生长温度(45～70 ℃)基本一致[16]。值得注意的是，菌株G.T1在环境温度降低至40 ℃时，仍具有一定的生长活性，因此在实际发酵过程中，该菌株在物料发酵的初始升温阶段同样可以发挥作用。如图4b所示，菌株G.T1生长pH值在6.5～9.5，其中最适生长pH值为7.5。通常情况下，有机固体废弃物在发酵制备有机肥的前中期，堆体pH值不断升高。菌株G.T1的生长最高pH值为 9.5，可见其在堆肥碱性发酵阶段仍可以继续进行正常的生长代谢活动，从而促进物料腐熟。如图4c所示，菌株G.T1在0～4 h处于生长迟缓期，在4～20 h处于快速生长期，而到24 h后基本处于稳定期。从图4d比生长速率可知，菌株G.T1在培养10 h时比生长速率最快，每小时可增长0.4个 OD600值。综上所述，温度65 ℃、pH值7.5培养条件下，菌株G.T1在豆渣物料中的生长性能最好，且在培养24 h后生长达到稳定期。

2.4 豆渣降解高温菌株G.T1对豆渣高温发酵的影响

为了进一步考察高温菌株G.T1在豆渣高温发酵过程中的作用，将40 mL OD600=10的G.T1菌株培养液，转接至发酵罐中含水量70%、pH值 7.5的1 kg 豆渣中，70 ℃保温发酵5 d，定期取样，测试各种理化指标(图5)。由于新鲜豆渣的C/N为21.96，符合有机肥发酵的初始C/N范围(20～30)[17]，因此发酵时无需再添加秸秆粉等辅料调节物料的C/N。

碳氮变化是物料腐熟过程中的基本特征之一，有机碳主要为微生物活动提供碳源，而总氮的变化则是微生物生理代谢转化的结果[18]。由图5可知， CK的TOC含量从初始的38.74% (0 d)上升到39.48% (5 d)，而试验组则从39.43%上升到39.99%。试验组初始TOC含量略高于CK，可能是因为添加的菌株G.T1中包含的有机碳所导致。CK和试验组发酵前后TOC含量的变化幅度均较小，这与豆渣中含有较多微生物难以利用的纤维类物质有关(表1)。CK的TN含量变化从1.76%(0 d)上升到2.34%(5 d)，而试验组的TN含量变化也从1.84%(0 d)上升到2.77%(5 d)。这可能是由于物料发酵过程中，干物质损失而导致的氮元素相对富集[19]。

C/N是常用的物料发酵腐熟指标之一[20]。CK的C/N从21.96 (0 d)上升到22.50 (3 d)并在第4 天开始下降，至发酵结束后C/N为16.86，达到腐熟的标准(C/N<20)。而试验组C/N的变化趋势也是先上升后下降，在发酵结束时C/N下降到14.43，明显小于CK。相关研究表明，物料的C/N越低，腐熟度越高。试验组腐熟程度高于CK，可能是由于菌株G.T1的添加加快了氮元素的转化，并且降解了部分有机质，使得试验组的腐熟程度更高。

此外，GI值能通过发酵产物对植物的毒性大小来反映有机肥腐熟程度，是评估有机肥腐熟最可靠、最有效的指标之一[21]。CK与试验组的GI值变化趋势不一致，CK的GI值先下降后上升，可能原因是发酵过程中会产生氨和部分有害有机酸，能减少种子萌发和抑制根发育[22]。而试验组GI值缓慢上升，从69.00% 0 d)上升至135.00%(5 d)。可能原因是加入菌株G.T1能降解豆渣中的有害有机酸，从而减少对植物的毒害作用，使得GI值上升。在豆渣发酵的第5天，CK的GI值达到86.42%，达到腐熟标准(GI>85%)[23]，而试验组则在第3天达到95.00%，比CK腐熟时间缩短40%。这些结果显示，在豆渣中添加菌株G.T1可以显著提高物料发酵的腐熟度。

氮、磷、钾是植物生长所需较多的营养元素[24]，肥料中氮、磷、钾含量能间接反映有机肥的肥力大小。如图6所示，经过高温发酵后，豆渣中氮、磷、钾含量均得到提升。试验组经发酵后的豆渣氮含量从18.40 g/kg 上升到27.72 g/kg，比CK提升了18.46%。磷含量从4.08 g/kg上升到7.69 g/kg，与CK相比提升了25.04%。钾含量从9.01 g/kg上升到17.92 g/kg，比CK高22.74%。试验组的氮、磷、钾总体含量与CK相比都得到了提升，可能是由于试验组的腐熟程度更高，肥料中氮、磷、钾浓缩更为明显导致的。因此，在豆渣高温制备有机肥中，可通过添加菌株G.T1提高有机肥的肥力。

3 结论与讨论

与畜禽粪污不同，豆渣本身不存在抗生素残留、重金属污染严重等一系列问题，是制备优质有机肥的良好原料，发展潜力巨大[25]。传统的堆肥发酵制备有机肥通常需要进行2～3个月，发酵过程中物料的温度长期保持在40～60 ℃。随着生态循环与环保理念的不断增强，这种传统发酵模式制备有机肥逐渐显示出以下不足之处：1)发酵启动慢，夏季豆渣在1 h内就会发生酸败，进而产生恶臭物质，污染环境并影响正常发酵；2)发酵温度低，病虫害杀灭不彻底：堆肥物料发酵温度在60 ℃以上发酵时间短，豆渣中污染的粪大肠杆菌等致病菌不易被彻底杀灭，施肥后易导致病虫害的传播；3)发酵温度低，腐熟不彻底：由于发酵温度低，发酵结束时，相当比例的物料养分仍为有机态，不能被作物直接吸收利用，导致肥效缓慢；4)发酵时间长，占地时间久，由于发酵温度低，发酵过程需要持续2～3个月，因而占用土地时间长，土地利用效率低下[6,26]。

近年来，利用高温微生物好氧发酵畜禽粪污制备有机肥成为畜禽粪污资源化的研究热点，与低温发酵制备发酵有机肥相比具有以下优点：1)微生物利用自身的代谢产能，使得发酵物料的温度长期保持在70 ℃以上，从而彻底杀灭粪污中的病虫害；2)高温下微生物生长代谢快，可将底物有机质快速转化为植物能利用的速效态，提升畜禽粪污制备有机肥的经济价值；3)通过高温好氧发酵制备有机肥，可以将腐熟发酵周期缩短至6～12 d，比传统堆肥发酵周期(35～45 d)，缩短了近90%，可以达到节约土地、高效产肥的目的[17]。

值得注意的是，豆渣农业废弃物目前还未见用于高温发酵制备有机肥的相关报道，且前期研究发现，鉴于豆渣在营养架构上与畜禽粪污差异较大，在畜禽粪污中应用的高温发酵微生物在豆渣农业废弃物中生长缓慢，无法实现正常的高温堆肥发酵，因此本研究旨在针对性地筛选适合豆渣农业废弃物的高温发酵微生物，并考察其在高温阶段中对豆渣物料转化的影响。

本研究中，从马粪、猪粪、豆渣及生活污泥中分离获得7株可在70 ℃环境中生长的菌株，经16 S rDNA分子鉴定，7株菌分别属于Geobacillustoebii、Geobacillussp.、Methylobacteriumsp.和Thermusthermophilus4个属种类别；经过试验验证，其中菌株G.T1(Geobacillustoebii)降解豆渣效果最为明显。

菌株G.T1生长温度范围在40～75 ℃，最适温度为65 ℃。该菌株生长pH值在6.5～9.5，最适pH值为7.5。在70 ℃条件下，发酵4 h开始进入快速生长期，并在24 h内可达到生长稳定期。

利用菌株G.T1模拟豆渣高温发酵过程(70 ℃)，发酵第3天，试验组GI值为95.00%，达到腐熟标准，比CK腐熟时间缩短40%。豆渣在第4天C/N(16.86)达到腐熟标准，高于CK腐熟度。该菌株对豆渣中的TOC含量影响不大，对TN含量提高有促进作用。

高温发酵5 d后的豆渣氮、磷、钾含量分别为27.72、7.69、17.92 g/kg，比CK分别提升了18.46%、25.04%、22.74%。因此，菌株G.T1能促进豆渣发酵腐熟，提高有机肥肥力。