外源赤霉素对烤烟叶面腺毛和香气物质的影响

贺凌霄，薛 刚，孙聚涛，张智强，丁永乐，杨铁钊，徐世晓，程昌合

(1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002； 2.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心，浙江 杭州 310024)

赤霉素与高等植物的生物合成调控、信号转导等多种生理活动发生互作[1-4]。研究发现，拟南芥腺毛的生长需要赤霉素进行信号转导[5-6]。烟草中，腺毛不仅能起到保护作用，还是一种重要的分泌器官，其分泌物与烟叶香气质和香气量的形成存在密切关系[7]，且在一定程度上反映烟叶的某些品质特性，如香气、吃味等[8-9]。

赤霉素与烟草叶面腺毛主要分泌物(西柏烷类)同为二萜类化合物，有共同的底物香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl-PP，GGPP)。在赤霉素途径中，GGPP经柯巴基焦磷酸合酶(Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、内-贝壳杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase，KS)的催化作用形成内-贝壳杉烯(Ent-kaurene)，然后在内-贝壳杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase，KO)、内-贝壳杉烯酸氧化酶(Ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下转化成GA12，后通过GA20-氧化酶(GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox) 等的作用合成具有生物活性的赤霉素[10-13]。而在西柏烷类途径中，首先，西柏三烯醇环化酶(Cembratrien-ol synthase，CBTS)经CYC-1基因编码[14]后，使GGPP发生环化反应，形成西柏三烯一醇[15]，然后在细胞色素 P450 羟化酶(Cytochrome P450 hydroxylase,CYP450)的作用下，西柏三烯一醇的第6位碳发生羟化反应形成西柏三烯二醇[16]。

围绕外源赤霉素对烟草生长和品质调控的影响，前人已开展了一些研究。周继华等[17]研究表明，对烟草外施一定浓度的赤霉素，烟株茎尖内源赤霉素与生长素含量提高，烟草株高与节间距显著增加。李振华[18]研究发现，烟草种子在100 mg/L GA3溶液引发24 h后，胚根萌发更加整齐一致。王林等[19]探究发现，增施赤霉素及生长素均可改善烤后烟叶的香气成分、物理特性和化学成分，且浓度越高效果越优。李浩亮等[20]发现，在打顶当天喷施20 mg/L赤霉素可明显提高烤后烟叶的钾含量,降低上部烟叶烟碱含量,并使上部和中部烟叶的主要化学成分具有较好的协调性。截至目前，外施赤霉素对烟草的影响研究多集中在对株高和种子萌发的调控方面，且对烤烟品质的影响多集中在理化性质方面，对烟草叶面腺毛及香气物质的研究较少[21-22]。鉴于此，以烤烟品种中烟100、NC71为材料，于苗期喷施赤霉素，研究外源赤霉素对烤烟叶面腺毛密度及分泌物的影响，以期增加烤后烟叶中性致香成分萜类降解产物的含量，提高烟叶品质，同时为明确赤霉素在西柏烷类物质合成代谢途径中的作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况及供试材料

试验于2019年在许昌市襄城县王洛镇进行，选择土壤肥力中上等且均匀、地势平坦、排灌方便、前茬一致的生茬地块作为试验地，土壤为褐土。供试烤烟品种为中烟100、NC71，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。赤霉素(GA3)粉剂(HPLC≥90.0%)由北京索莱宝科技有限公司生产。

1.2 试验设计

试验共4个处理，分别为未经赤霉素喷施的中烟100(ZY100)、NC71和经赤霉素喷施的中烟100(ZY100G)、NC71(NC71G)。烤烟于2019年3月1日播种，5月1日移栽，移栽时对准烟草茎尖生长点喷施赤霉素，喷施时间为傍晚17:30—18:30，喷施时液滴细小且均匀，用量以喷施部位药液下滴为度。赤霉素喷施液由100 mg/L赤霉素和20 mL/L表面活性剂吐温80组成，赤霉素质量浓度设定参照刘超等[23]的方法。7月10日打顶，其他栽培措施按照当地优质烟叶生产技术规范执行。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烟草腺毛形态观察和腺毛密度统计 在中部叶叶龄50 d时取样[24]，用2 g/L罗丹明B水溶液染色，叶片上表面朝上置于VHX-600V超景深显微镜(日本基恩士公司)下进行腺毛形态观察和腺毛密度统计。每个样本取3个叶片，每个叶片观察3个视野计数。

1.3.2 叶面腺毛分泌物含量测定 在中部叶叶龄60 d时取样[24]，参照陈伟等[25]的方法，在烟叶主脉两侧分别截取直径为9 cm的叶圆片共20片，将各处理叶圆片置于500 mL二氯甲烷中浸提。收集剩余的二氯甲烷加入10 g无水硫酸钠，过滤后加入1 mL含正-17-烷醇的内标，并在旋转蒸发仪中浓缩至50 mL，经氮吹和衍生化反应后，进行GC-MS检测分析。通过NIST12检索谱库定性,并使用内标法进行定量。

1.3.3 中性致香成分含量检测 同时蒸馏萃取装置一端接入500 mL圆底烧瓶，加入10.000 g烤后烟样(C3F)、1.0 g柠檬酸和350 mL蒸馏水，恒温电热套加热；另一端接入250 mL圆底烧瓶，加入40 mL二氯甲烷、500 μL含硝基苯的内标，恒温水浴锅加热。2.5 h后收集250 mL圆底烧瓶中的液体，加入10 g无水硫酸钠过滤后，在旋转蒸发仪中浓缩至1 mL左右，采用GC-MS进行检测分析。通过NIST12检索谱库定性，并使用内标法对物质进行定量，并对测得的物质按照姜慧娟[26]的方法进行分类。

1.3.4 内源激素含量测定 喷施赤霉素后0、10、20、30、40、50、60、70 d，采集各处理中部叶 0.5 g新鲜烟草样品，用液氮速冻后，存放于超低温冰箱中，采用由中国农业大学化控中心提供的酶免疫试剂盒(ELISA)[27]进行测定。

1.3.5 烟草叶片总RNA的提取及基因表达分析 采用Plant RNA isolation Aid提取供试材料中部叶叶龄60 d时叶片总RNA，利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)将待测RNA逆转录成cDNA，引物采用Roche LCPDS2软件设计(表1)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 荧光定量引物序列Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers

利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler®480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应。以NtL25为内参基因，依据Ct值,计算相对表达量并作图。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据计算和作图，使用SPSS 20.0统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 外源赤霉素对烤烟叶面腺毛形态和密度的影响

根据图1可知，NC71G的腺毛长度显著高于其他处理，较未喷施的NC71显著增加了118.95 μm；NC71、NC71G的腺毛直径显著大于ZY100、ZY100G；

腺毛密度表现为NC71G>NC71>ZY100G>ZY100，其中NC71G处理显著高于NC71处理，ZY100G处理显著高于ZY100，喷施赤霉素后烤烟叶面腺毛密度平均提高30.97%。可见，喷施赤霉素有助于提高烤烟叶面腺毛密度。

2.2 外源赤霉素对烤烟叶面腺毛分泌物的影响

根据图2可知，西柏烷类在烤烟叶面腺毛分泌物中含量最高。中部叶叶龄60 d时，NC71的西柏烷类含量明显高于ZY100。喷施赤霉素后，2个烤烟品种西柏烷类含量占比均有明显增加，烷烃类含量占比明显减少。ZY100G、NC71G的西柏烷类含量均高于未喷施赤霉素处理，分别提高40.91%、37.92%；叶面腺毛分泌物总含量分别提高了39.23%、35.64%，表明茎尖喷施赤霉素对烤烟叶面分泌物含量影响较大，特别是西柏烷类含量，有助于提高烟叶的香味特征。

2.3 外源赤霉素对烤后烟叶中性致香成分的影响

根据图3可知，新植二烯在中性致香成分中占比最大。叶面喷施赤霉素后，烤后烟叶类西柏烷降解产物、类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物、其他类中性致香成分含量均显著增高，其中NC71G各类中性致香成分含量显著高于其他处理。喷施赤霉素后，2个烤烟品种类西柏烷降解产物含量平均提高了70.35%，类胡萝卜素降解产物含量平均提高了85.89%，美拉德反应产物含量平均提高了70.52%，芳香族氨基酸降解产物含量平均提高了86.76%，表明叶面喷施赤霉素对中性致香成分的影响较大，有助于提高烤烟的香味特征。

2.4 外源赤霉素对烤烟内源赤霉素含量的影响

根据图4可知，喷施赤霉素20～70 d，NC71G、ZY100G内源赤霉素含量较未喷施赤霉素的NC71、ZY100显著增加。喷施赤霉素后40 d，4个处理内源赤霉素含量均达到高峰，之后逐渐下降。ZY100G在喷施赤霉素10 d后内源赤霉素含量显著高于其他处理，NC71G在喷施赤霉素20 d后内源赤霉素含量显著高于NC71，且与ZY100差异不显著。可见，苗期喷施赤霉素有助于增加烤烟植株内源赤霉素含量，但不同品种间对外源赤霉素的响应快慢存在差异。

2.5 外源赤霉素对烤烟赤霉素和西柏烷类物质相关基因表达量的影响

根据图5可知，喷施外源赤霉素后，2个烤烟品种CYC-1、CPS和GA20ox基因的表达量均上调，GA2ox基因的表达量下调。ZY100G除CPS表达量与ZY100差异不显著外，CYC-1、GA20ox、GA2ox基因的表达量均与ZY100有显著差异；NC71G 以上4个基因的表达量与NC71均有极显著差异。

3 结论与讨论

研究表明，细胞外赤霉素浓度高时,赤霉素受体GA IN-SENSITIVE DWARF1(GID1)通过其C端结构域与赤霉素结合并引发相关应答反应，从而提高内源赤霉素含量[28]。本研究在喷施赤霉素后每隔10 d测定1次各处理内源赤霉素的含量，发现苗期喷施赤霉素有助于增加植株内源赤霉素的含量，同时赤霉素合成正调控基因CPS、GA20ox表达量上调，负调控基因GA2ox表达量下调。

腺毛是存在于大多数维管植物表面的表皮细胞突起，保护植物免受昆虫、食草动物、紫外线和水分流失的侵害[29-30]。此前，有研究已确定，赤霉素在拟南芥腺毛生长过程中起着重要作用[5-6，31]。MATIAS-HERNANDEZ等[32]对转录因子TEMs功能的发现，强调了赤霉素的运输和分布对拟南芥腺毛形成调控的重要性。本研究结果表明，外源赤霉素对烤烟叶面腺毛密度有正向调节作用，与前人研究结果[5-6]相近。有研究表明，赤霉素信号传导影响腺毛生长关键基因的启动。在影响腺毛生长的基因中，GLABRA1(GL1)和TRANSPARENT TESTA GLABRA(TTG)基因的作用是启动腺毛的生长[33-34]，其中GL1蛋白序列与被赤霉素上调的Myb家族转录因子同源[35-36]，而TTG基因在腺毛形成中的功能可被与GA信号传导有关R基因所替代[37]。

烟草叶面腺毛除保护叶片外，还会特异性合成并分泌二萜化合物等香味物质[38]。本研究发现，外源赤霉素提高了腺毛分泌物含量，其中，二萜化合物的主要组分类西柏烷及其降解产物含量均有显著增加，四萜类物质类胡萝卜素降解产物含量显著增加。有研究表明，腺毛密度是腺毛分泌物积累的基础条件[39]。在青蒿的研究中发现，内源赤霉素含量提高有利于其萜类物质含量的增加[40]。赤霉素是二萜化合物的一种，与西柏烷类、类胡萝卜素的直接前体物质脱落酸有着共同的前体物质GGPP[10-12，41-42]。通过施加外源赤霉素可以增加内源赤霉素的产生，节省了前体物质GGPP在此合成途径中的消耗，进而增加了其他萜类合成途径前体物质的可用量，提高了西柏三烯醇环化酶[43]、八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase，PSY)[44]的活性，并促进了西柏三烯醇环化酶的编码基因CYC-1表达量的上调，从而增加了西柏烷类、类胡萝卜素的合成与积累。

本研究发现，在苗期对烟草茎尖喷施外源赤霉素后，不仅有效增加了烟草叶面腺毛密度，并且通过增加烟草内源赤霉素含量，提高了叶面腺毛分泌物萜类物质的含量，进而增加了萜类化合物西柏烷降解产物和类胡萝卜素降解产物的含量，表明外源赤霉素对烤烟叶面腺毛生长具有正向调节作用，而且增加了叶面腺毛分泌物的含量，提高了烟叶质量，为研究赤霉素在萜类代谢中的作用提供了借鉴意义。