襄阳两种土壤类型对花生贮藏期黄曲霉菌 及其毒素污染风险的影响研究

朱梦洁，王 雪，张姝娟，张 倩，褚乾梅，王 盾*，冯 鹏*

(1.襄阳市农业科学院，湖北 襄阳 441057； 2.农业农村部生物毒素检测重点实验室，湖北 武汉 430062)

花生是我国重要的油料作物和经济作物，花生种植面积在我国油料作物中居于第三位，但其总产量居于首位，其单产高、含油量高、营养价值高，一直是我国的出口创汇农产品[1]。然而，由黄曲霉菌(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)等侵染花生后产生的黄曲霉毒素具有剧毒和强致癌性，是威胁花生品质安全、限制产业发展和出口贸易的主要危害因子[2]。黄曲霉毒素污染既可发生在花生结果、成熟和收获的过程中，也可发生在花生干燥、收购、加工、仓储和运输等过程中[3]。花生生长过程中发生的毒素污染称为收获前黄曲霉毒素污染(preharvest aflatoxin contamination)，收获晾晒后发生的毒素污染称为收获后污染(postharvest aflatoxin contamination)，迄今我国主要针对花生收获后贮藏期间黄曲霉毒素污染展开相关研究[3-4]。我国幅员辽阔，南北气候、土壤、环境等差异较大，花生黄曲霉毒素污染呈现明显的地域特征[5]，近年来，随着气候、环境和生产方式的变化，花生黄曲霉毒素污染有局部加重趋势，总体表现为由北至南，黄曲霉毒素污染逐渐加重。华北地区常年气候干燥、年均降水量少，花生受黄曲霉污染程度较轻；而长江流域及东南沿海地区高温高湿、梅雨季节持续时间长，有利于黄曲霉侵染花生，从而致使黄曲霉毒素污染严重[6]。

襄阳位于汉水中游，地处暖温带向亚热带过渡地区，东经110°45'～113°47'，北纬31°13'～32°35'，具南北过渡性气候特点，属北亚热带季风气候雨养农业区，区域热量好、光照足、积温多、降水均匀，自然资源条件优越，生态条件适宜花生生产种植，是全省、全国花生主产区和主要集散地之一。花生是一种具有地上开花、地下结果特性的农作物，花生生长期间，其荚果直接与土壤接触，研究表明，土壤是花生黄曲霉菌的主要来源，花生中的黄曲霉与土壤中黄曲霉有直接的联系[7-9]。张初署和朱婷婷等对我国南北不同产区花生黄曲霉毒素污染情况的调查表明，我国长江中下游地区土壤中具有较高的黄曲霉污染风险[2,10]。然而，不同土壤类型与花生中黄曲霉毒素污染的联系有着不同的报道：砂壤土有利于黄曲霉孢子的快速传播与增殖，特别是在生长后期遇到高温干旱的条件，花生受黄曲霉毒素污染的风险较高；相反，由于黏度较高的土壤具有较好的持水力，因此受到干旱胁迫的可能性较低，从而可以减少花生黄曲霉毒素的污染水平[11]。然而，张杏在不同土壤类型黄曲霉菌株分布的调查中发现，黄黏土中的菌落数显著高于砂壤土，可能由于砂土保水性能最差，易干旱，最不利于黄曲霉菌生长；黏土保水性能最好，最利于黄曲霉菌生长[12]。迄今我国主要针对花生收获后贮藏期间黄曲霉毒素污染展开相关研究，同一气候条件下，同一地区不同土壤类型对收获后花生黄曲霉毒素污染的影响还鲜有报道。

襄阳地处汉江两支流交汇处，具有砂壤土和黄黏土两种典型的土壤类型。因此，本文拟以本地花生主产区主推品种为研究对象，通过对襄阳特有的两种土壤类型的差异进行研究，掌握襄阳花生遭受黄曲霉毒素污染的分布规律及特征，分析土壤类型与花生贮藏期黄曲霉污染风险的相互关系，为襄阳地区花生黄曲霉毒素污染预警和精准防控提供理论依据和数据支撑，保障本地花生消费安全，促进花生产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘油(Aladdin)；甲醇(美国Fisher)；DG-18琼脂培养基(海博生物)；次氯酸钠(山东瑞泰奇洗涤消毒有限公司)；曲霉素琼脂基础培养基(AFPA)(海博生物)；蒸馏水(UPH-Ⅲ-10型优普超纯水制造系统制备)；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱(江苏省苏薇薇生物研究有限公司)；乙腈中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2混标(北京坛墨质检科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

5810R型高速低温离心机(Eppendorf)；JYL-G12E型高速破壁机(九阳股份有限公司)；CP4102型电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)；MJ-250-1型霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；YXQ-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)；HX-G型光化学柱后衍生仪(武汉恒信试剂科技有限公司)；岛津LC-20A液相色谱仪；DQ-101型台式方形中药切片机(温岭市林大机械有限公司)；KB5010型试管振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；BSC-1600132型生物安全柜(莱特(南通)科学仪器有限公司)；THZ-C-L型台式冷冻恒温振荡器(太仓市强乐实验设备有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

根据花生主产区土壤类型分布情况分别从湖北省襄阳市的枣阳市、宜城市、谷城县、襄州区等4个花生主产区共12个乡镇选择取样地，其中包括以黄黏土类型为代表的乡镇7个，以砂壤土类型为代表的乡镇5个。每个乡镇挑选3个取样点，采样点覆盖主产区中典型的河岸带砂壤土和岗地黄黏土两种最典型的土壤类型。在花生收获期取样，每个采样点取5 kg当地花生主推品种小白沙荚果样品，取后及时晾晒，样品晒干后悬挂放置于干燥通风的仓库中[13]，分别贮藏15 d和365 d，用于花生不同贮藏期黄曲霉毒素含量测定试验。

1.3.2 花生贮藏期黄曲霉毒素含量测定

称取1 kg花生籽粒切片粉碎，混合均匀后缩分至100 g，称取5.00 g试样于离心管中，加入20.0 mL的甲醇/水(70∶30)溶液，涡旋混匀，置于试管振荡器中震荡20 min，在6000 r/min下离心5 min，取5 mL上清液加入25 mL纯水稀释。使用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱对样品进行浓缩和纯化，最后用甲醇洗脱并定容至1 mL。洗脱液用0.22 μm滤膜过滤后转移至进样瓶中，用于HPLC分析。HPLC检测条件：反向C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)、柱温 40 ℃；流动相为甲醇/水(45∶55)，流速为1.0 mL/min；激发波长 360 nm、发射波长 440 nm；进样量为20 μL。

1.3.3 花生黄曲霉污染率的检测

挑选完整没有裂缝的花生，用次氯酸钠溶液浸泡消毒2 min，接着用无菌蒸馏水清洗3遍[14]，在灭菌的玻璃培养皿中放置灭菌后的滤纸，再在滤纸表面加入无菌水以湿润整张滤纸，将花生籽粒平铺在培养皿中，于温度28 ℃、湿度70%～80%的霉菌培养箱内培养7 d。经形态学初步观察，挑取能够产生外观可见长有黄色孢子的菌落在DG18培养基上进行纯化，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的菌株于AFPA培养基上进行显色培养，阳性菌株送北京擎科测序公司武汉测序部进行ITS序列测序，用于菌株鉴定，并计算黄曲霉污染率。

1.3.4 花生壳内壁和籽粒上黄曲霉菌侵染率的测定

从每份花生样品中随机取100颗没有裂缝的花生，次氯酸钠消毒后用无菌蒸馏水冲洗，接着在超净工作台里剥壳、剪碎，每颗花生随机取四分之一的花生壳和二分之一的花生仁分别放在装有无菌蒸馏水的三角瓶中，放入恒温摇床中28 ℃震荡提取1 h。分别取100 μL提取液在DG18固体培养基上均匀涂布[15]，28 ℃培养6～7 d后观察长菌情况。将形态疑似黄曲霉的菌株再用AFPA培养基显色筛选培养，阳性菌株送测序，根据ITS序列信息鉴定黄曲霉菌株。

1.4 数据统计与分析

采用 WPS Office统计软件进行花生收获后不同贮藏期黄曲霉菌污染和黄曲霉毒素含量的统计及处理绘制，并对花生黄曲霉菌污染与土壤类型的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 良好条件下不同贮藏时间对不同土壤类型所产花生中黄曲霉毒素含量变化的影响

据调查，襄阳产区花生从收获到抵达消费者手中平均需要15 d左右，若作为自留种或其他用途则可能贮藏1年左右，因此分别测定了收获后贮藏15 d和贮藏365 d后花生中黄曲霉毒素含量，观察贮藏时间对不同土壤类型所产花生中黄曲霉毒素含量的影响见表1，花生贮藏15 d后所有样品中均未检测出4种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)。在储存1年后的样品中，所有砂壤土所产花生中4种黄曲霉毒素也均未检出，黄黏土所产花生中所有样品均未检出AFB2、AFG1、AFG2，但闫营和杨档样品中检出AFB1，含量分别为1.56±0.29 μg·kg-1和1.70±0.41 μg·kg-1，其中，检出样品黄曲霉毒素含量也是在限量范围内，说明襄阳不同土壤类型所产花生的品质安全水平都比较高，其黄曲霉毒素污染风险相对存在于黄黏土所产花生的产后贮藏期。

表1 不同贮藏期花生中黄曲霉毒素含量 /(μg·kg-1) Table 1 Aflatoxins content in peanut after different storage periods

2.2 花生壳内壁和籽粒上黄曲霉菌侵染率实验

为了分析花生贮藏过程中黄曲霉菌侵染程度与土壤类型之间的关系，我们进一步测定了花生不同部位上的黄曲霉菌侵染率，并与土壤类型进行关联分析。结果表明：砂壤土中花生壳内表面黄曲霉污染发生率为6.67%，花生籽粒上未检出黄曲霉；黄黏土中花生壳内表面黄曲霉污染发生率为38.10%，是砂壤土中的5.71倍，差异显著；花生籽粒上黄曲霉污染发生率为4.76%，高于砂壤土，差异不显著 (图1)。

2.3 人工模拟恶劣条件下花生的黄曲霉菌污染率情况实验

为了进一步评判不同土壤类型所产花生遭受黄曲霉污染的风险情况，根据襄阳产区花生收获后较易出现的夏末秋初的高温髙湿气候，将花生籽粒置于温度28 ℃、相对湿度70%～80%的条件下贮藏7 d进行模拟实验。结果表明：砂壤土所产花生中的黄曲霉污染发生率在1.25%～9.78%之间，平均值为4.11%，且全部在10%以下；黄黏土所产花生中的黄曲霉污染率在3.47%～20.57%之间，平均值为13.61%，且绝大部分都在10%以上。由此可见，在高温高湿条件下，黄黏土所产花生中的黄曲霉污染风险显著高于砂壤土中所产花生中的黄曲霉污染风险 (图2)。

3 讨论与结论

气候条件和干旱胁迫是影响花生生长过程中荚果防御黄曲霉菌和抑制产毒的重要因素[16-18]。本研究表明，襄阳地区所产花生在收获期均未检出黄曲霉毒素，主要因为在花生生长当年，襄阳产区降水量适中，既没遇到明显的高温干旱胁迫，也没有遭遇收获期连阴雨的气候灾害，花生荚果发育良好，且成熟后的花生具备充分晾晒干燥的天气条件；在相对良好的条件下储存1年后，不同土壤类型产出的花生污染风险就表现出明显差异：黄黏土所产花生黄曲霉毒素检出率显著高于砂壤土中所产花生(表1)。该结果表明，在气候条件良好或灌溉条件良好的情况下，襄阳产区花生中的黄曲霉毒素风险主要存在于贮藏期，且黄黏土产区风险高于砂壤土产区，这可能是因为相较于砂壤土，黄黏土更易吸附黄曲霉毒素且毒素分解速度更慢[19-20]。

花生收获前所感染的黄曲霉菌主要来自于土壤，荚果在发育过程中可能发生不同程度的黄曲霉菌侵染[21]，土壤类型能够影响花生收获后贮藏和加工过程中的毒素污染水平。本研究从不同角度设计试验，分析比较了两种不同典型土壤类型与花生的黄曲霉菌侵染率之间的关系。果壳是花生防御土壤中有害真菌侵染的第一道防线。从花生壳内表面和籽粒上黄曲霉菌侵染率实验可看出，无论在花生壳还是花生仁中，黄黏土中产出的花生黄曲霉菌侵染率都显著高于砂壤土中产出的花生黄曲霉菌侵染率(图1)，表明黄曲霉菌对花生荚果的侵染程度在黄黏土的土壤环境下比砂壤土环境下更高。李新国、熊路等研究认为，砂壤土保水性差，易受高温干旱胁迫，黄曲霉侵染率较高[22-23]。而我们的试验中由于降水或灌溉条件较好(砂壤土为典型的汉江沿岸或夹河套地形)，砂壤土产区中很少存在干旱胁迫，反而砂壤土中所产花生的黄曲霉菌侵染率低于黏土中所产花生的黄曲霉菌侵染率。一般认为，当土壤中水分条件良好时，土壤中黄曲霉菌的种群密度越高，花生受黄曲霉侵染的风险也越高[24]。国内张杏等调查的结果中显示，黏土中黄曲霉菌的种群数量普遍高于砂壤土[12]，本研究组张姝娟等前期对襄阳不同花生产区土壤中黄曲霉菌的污染分布和产毒力研究结果也显示，黄黏土中的黄曲霉菌分布密度明显高于砂壤土(待刊)，可较好地解释襄阳黄黏土产区花生中黄曲霉菌侵染率高的原因，从而增加了该产区花生荚果在贮藏期遇到高温髙湿环境后产毒的风险。

收获前发生黄曲霉菌侵染的少数花生种子在湿热条件下，其携带的黄曲霉菌能够快速增殖从而造成花生大范围的感染[25]。丁宁等[26]分析了中国四大花生主产区不同贮藏条件下花生受黄曲霉侵染及黄曲霉毒素污染程度及其在贮藏过程中的变化规律，发现贮藏环境温度越高、湿度越大，花生越易被黄曲霉侵染，且花生 AFB1污染水平越高。襄阳产区花生收获后，正值夏末高温多雨季节，产后花生贮藏过程中经常暴露于高温高湿环境，易造成产后黄曲霉毒素污染。本研究模拟了襄阳产区花生籽粒贮藏期遭遇高温髙湿等恶劣条件下的黄曲霉菌污染率实验，结果表明，在高温髙湿条件下贮藏7 d后，襄阳产区花生整体上均具有较大的黄曲霉菌污染风险，其中黄黏土产区的风险比砂壤土产区更高。高温(28 ℃或以上)、高湿(相对湿度70%～80%)的条件非常适合花生荚果上黄曲霉菌的繁殖和生长，同时也是襄阳地区夏末秋初花生贮藏期间经常出现的气候条件，襄阳花生收获后如遇到此类温室天气，将面临极大的贮藏期霉菌污染风险，影响花生消费安全，不利于花生产业健康发展。

本研究首次对襄阳产区两种典型土壤类型生产的花生进行黄曲霉毒素含量、黄曲霉菌侵染率测定分析，并探讨了黄曲霉菌及其毒素污染与土壤类型之间的关系。通过研究可得出以下结论：第一，在襄阳特有的气候条件和土壤条件下，襄阳产区花生中的黄曲霉污染风险主要存在于贮藏期，如遇收获期连续阴雨或贮藏期高温髙湿气候条件，黄曲霉菌的污染率则有所提高，容易造成潜在的黄曲霉毒素污染；第二，从襄阳两种典型的土壤类型来看，黄黏土产区比砂壤土产区的花生具有更高的污染风险，表明在襄阳独特的气候条件下，两河沿岸的砂质壤土是非常理想的花生高品质产区。因此建议襄阳产区在花生黄曲霉污染防控策略上可结合当地花生主推品种，应尽可能采取砂壤土种植，或在黄黏土产区加强土壤中黄曲霉的防治措施，从而经济有效地控制花生贮藏期黄曲霉污染风险。