一株内循环流水养殖池塘光合细菌的分离鉴定及氮磷去除能力的研究

阳龙江，韩璐璐，杨成年，翟旭亮，梅会清，朱成科

(1 西南大学水产学院，重庆 荣昌 402460；2 重庆市水产技术推广总站，重庆 渝北 401121)

近年来，集约化、高密度养殖模式导致养殖水体氮(N)、磷(P)含量普遍超标，不仅制约了水产养殖业的发展，也影响着生态环境与人类的健康。池塘内循环流水养殖(internal-circulation pond aquaculture,IPA)是传统池塘养鱼和流水养鱼相结合的一种生态养殖模式。该养殖模式将传统养殖池塘进行改造，将养殖过程中所需要的养殖区和净化区分隔单独建造，养殖区养殖吃食性鱼类，净化区套养滤食性鱼类和种植水生植物净化水质，并且安装在养殖区末端的吸污装置可以将残饲和粪便吸收到沉淀池进行处理[1-2]。这种养殖模式不仅节省成本，方便管理，还有利于环境保护和提高经济产量[3]。但研究显示，该模式也存在一些问题，比如吸污系统吸污不彻底，只有20%～30%的残饲粪便被转移出养殖水体，大量残饲粪便进入净化区，导致水体中的营养盐和其他有机污染物大量累积，使得净化区负荷增大，系统无法有效运行[4-5]。提高净化区的净化能力是保证池塘内循环流水养殖模式的有效运行的关键。目前，净化处理的主要方法有物理法、化学法和生物法三大类，其中生物法以见效快，安全、对环境无污染、可持续应用、对养殖品种无危害的优点得到广泛应用[6]。

光合细菌(photo synthethetic bacteria,PSB)是具有光合色素，在光照厌氧条件下可以进行光合作用的一类细菌，能有效分解水体中的氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和含磷化合物等物质，从而达到改善和净化水质的目的[7-9]。如红假单胞菌PSB1对模拟养殖水氨氮、亚硝酸盐氮的去除率高达97.00%和73.56%[10]；沙氏外硫红螺菌对氯化铵培养基的氨氮去除率为94.42%，对亚硝酸钠培养基的亚硝酸盐氮的去除率接近100%(低于检测下限0.003 mg/L)[11]；在投入1%沼泽红假单胞菌后，湖泊上覆水氨氮、总氮、可溶性磷和总磷含量下降了50.4%、20.5%、83.7%和63.0%[12]。目前，光合细菌对氮磷去除的研究大多集中于传统养殖池塘[13-14]，在内循环流水养殖池塘上的还未见相关报道。

本研究从重庆潼南区内循环流水养殖池塘中分离得到一株光合细菌，探究在室内模拟条件下该菌株对内循环流水养殖池塘净化区水体的去污能力，以期为内循环流水养殖池塘净化区中光合细菌的应用提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本试验所使用菌株GR01从重庆市潼南区内循环流水养殖池净化区的底泥中分离得到。

1.1.2 仪器与试剂

光学显微镜(日本OLYMPUS公司)、恒温摇床(江苏省金坛市盛威实验仪器厂)、PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、紫外分光光度计(北京普源精电科技有限公司)、离心机(德国Eppendorf公司)。

DNA提取试剂盒(Takara公司)、PCR扩增所用rTaq DNA聚合酶及其他试剂(Takara公司)、DH5α(Takara公司)、琼脂糖G-10(BIOWEST公司)。

1.1.3 富集培养基

富集培养基：NH4Cl 1.0 g，NaHCO31.0 g，K2HPO40.2 g，CH3COONa 2.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1.2 g，T.m贮液10 mL，生长素辅助因子1 mL，蒸馏水1 000 mL。T.m贮液:FeCl3·6H2O 5 mg，CuSO4·5H2O 0.05 mg，H3BO31 mg，MnCl2·4H2O 0.05 mg，ZnSO4·7H2O 1 mg，Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg，蒸馏水 1 000 mL。生长素辅助因子：维生素B1 100 mg，生物素1 mg，烟酸0.1 mg，对氨基苯甲酸10 mg，蒸馏水1 000 mL。

1.2 分离鉴定

分离纯化 将采集的底泥加入富集培养基中，在28 ℃、2 000 Lx光照条件下培养108 h，取上层深红色富集菌液移入新的富集培养基中，重复上述方法进行富集3～4次，使光合细菌成为优势菌群。然后将富集的菌液进行梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)，将梯度稀释的菌悬液分别移出1 mL加入半固体培养基，在28 ℃、2 000 Lx光照条件下培养48 h，若单菌落不明显，继续培养24 h。然后挑取红色单菌落，在固体培养基上接种，使用焦性没食子酸法并用固体石蜡密封进行厌氧培养，在28 ℃、2 000 Lx光照条件下培养，待培养基48 h ，挑取培养基上长出的红色单菌落，纯化2～3次，经筛选得到菌株GR01，扩大培养获得GR01菌液。然后取500 μL菌液加入500 μL质量浓度为40%的甘油中，-80 ℃保存。

形态学鉴定 将纯化后的光合细菌GR01接种于固体培养基上，在光照2 000 Lx，温度28 ℃条件下培养48 h，观察其菌落形态特征，并进行革兰氏染色在光学显微镜下观察其菌体形态。

生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]，鉴定项目包括葡萄糖、蔗糖、醋酸钠、甲酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、丙酮酸钠、琥珀酸钠、硫化氢、硫代硫酸钠利用试验。

16S rDNA鉴定 以提取的细菌DNA为模板，进行16S rDNA扩增。引物为细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3’)；PCR反应体系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，r Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，10 mM dNTPs 1 μL，ddH2O 39.6 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，31个循环，最后72 ℃终延伸10 min，16 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后在凝胶成像系统下观察扩增片段的大小。用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行PCR产物回收纯化，pMD-19T载体连接，转化至DH5α感受态细胞内，挑选阳性克隆送至华大基因公司测序，将测序得到的16S rDNA基因序列在GenBank数据库中比对，进行同源性分析，用Clustalx 1.83进行序列比对，最后用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

吸收光谱测定 取50 mL菌液于5 000 r/min、4 ℃下离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水混合均匀，重复3次。弃去上清液，将离心后的细菌接种到250 mL灭菌培养基中，并加入一定量液体石蜡，于温度为28 ℃，光照为2 000 Lx条件下培养108 h。取菌液10 000 r/min离心2 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤，反复吹打，使其悬浮于60%的蔗糖溶液中混合均匀，用质量分数为60%的蔗糖溶液作为空白参比，紫外可见分光光度计扫描300～900 nm波长范围，绘制吸收光谱。

1.3 培养条件优化

生长曲线 取50 mL菌液于5 000 r/min、4 ℃下离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水混合均匀，重复3次。弃去上清液，将离心后的细菌接种到250 mL灭菌培养基中，并加入一定量液体石蜡，在温度为28 ℃，光照强度为2 000 Lx的生化培养箱中厌氧培养。每组试验设置3个平行试验，每隔12 h测定吸光度A660，共测定168 h。

温度将接种好细菌的液体培养基(接种方法同上)置于不同温度(16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃、44 ℃、48 ℃、52 ℃)，光照强度为2 000 Lx的生化培养箱中厌氧培养108 h，测定吸光度A660。

pH 配制不同梯度pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的液体培养基，接种细菌(接种方法同上)，在温度为28 ℃，光照强度为2 000 Lx的生化培养箱中厌氧培养108 h，测定吸光度A660。

配置不同盐度(5‰、10‰、10‰、20‰、30‰、40‰、50‰)的液体培养基，接种细菌(接种方法同上)，在温度为28 ℃，光照强度为2 000 Lx的生化培养箱中厌氧培养108 h，测定吸光度A660。

1.4 去污能力研究

试验地点位于重庆市潼南区的一处内循环流水养殖池塘(图1)，占地面积约3.33 hm2，平均水深2～3 m，水由溪流汇入。

该内循环流水养殖池塘共6条流水槽，每条流水槽长25 m、宽5 m、深2 m，每条流水槽底部和四周槽体等主体均采用不锈钢框架、全浮式结构，表面光滑，四周固定数个泡沫浮筒用于提供浮力。所有养殖槽后端有一长30 m、宽2 m的集污区，配置一台3 kW的吸污泵。流水槽进水端与出水端采用不锈钢拦网加聚乙烯网片分别与槽外、吸污区隔离。该池塘其他区域作为水质净化区，分别套养滤食性鱼类和种植水生植物。

测定方法：氨氮测定采用HJ 535—2009 《纳氏试剂分光光度》[16]；亚硝酸盐氮测定采用GB/7493—87 《分光光度法》[17]；总氮测定采用HJ 636—2012 《碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》[18]；总磷测定采用GB 11893—89 《钼酸铵分光光度法》[19]。

1.5 数据分析

使用Excel 2016进行数据整理及制图，运用SPSS 25.0对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 分离鉴定

2.1.1 形态学鉴定

菌株GR01菌落呈红色，圆形，湿润，表面光滑，中间微凸，边缘整齐，直径为2～3 mm；革兰氏染色结果显示该菌为革兰氏阴性短杆状菌，无芽孢，有较强活性，且多数单个排列。

2.1.2 生理生化鉴定

生理生化结果显示，菌株GR01可以将醋酸钠、乳酸钠、丙酮酸钠和琥珀酸钠作为碳源，不能将葡萄糖、蔗糖、甲酸钠和柠檬酸钠作为碳源；该菌株可以将硫代硫酸钠作为无机电子供体，不能将硫化氢作为无机电子供体。

2.1.3 16S rDNA基因序列分析及构建系统发育树

以菌株GR01的DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到1 500 bp左右长度的条带。对目的条带经过胶回收、纯化、与pMD-19T vector载体连接、转化E.coli DH5α感受态细胞、挑选阳性克隆测序，发现菌株GR01所获得的16S rDNA基因部分序列片段大小为1 490 bp。将菌株GR01提取的16S rDNA序列提交GenBank，用Blast比对分析，结果表明菌株GR01与北京红篓菌Rhodocistapekingensis(FM177580、AM690346)的序列相似性高达99.8%。结果表明，菌株GR01与北京红篓菌聚为一支。

2.1.4 吸收光谱测定

在300～900 nm波长范围内，菌株GR01活细胞菌液紫外可见分光光度计(EVOLUTION 201)扫描的吸收光谱如图2所示。

在379 nm、469 nm、591 nm、805 nm、867 nm处有明显特征吸收峰，469 nm处有类胡萝卜素的特征吸收峰，867 nm、805 nm、379 nm处的吸收峰为细菌叶绿素a的特征吸收峰，591 nm处为叶绿素b的特征吸收峰。结果表明，菌株GR01活细胞体内含有叶绿素a、b和类胡萝卜素，在798 nm处左右有最低吸收峰。

2.2 最优培养条件的研究

2.2.1 菌株GR01的生长曲线

菌株GR01厌氧培养每隔12 h测定吸光度，共测量168 h，测得菌株GR01的生长曲线见图2A。由图2A可知，菌株GR01在第12 小时，培养液颜色无明显变化，细菌繁殖速度较慢，数量较少，处于延迟期；第48～108 小时，培养液颜色明显变为红棕色，吸光度值呈几何倍数增长，此时期细菌繁殖速度快，数量增长速度快，属于对数生长期；在第120～144 小时，菌液颜色更加深，有少量红褐色结块出现，吸光度值保持相对稳定，有小幅度下降，属于稳定期；第168 小时，红褐色变浅，培养瓶底部出现大量红褐色结块，细菌大量死亡，属于衰亡期。所以，后续培养条件优化试验测定均采用108 h的吸光度。

菌株培养条件的优化如图3所示。

2.2.2 温度对菌株GR01生长的影响

如图3B所示，本菌株适合生长的温度范围为20 ℃～36 ℃，培养温度为16 ℃～28 ℃时，温度越高，菌株生长速度呈上升趋势，在28 ℃～52 ℃范围内，随温度升高，生长速度呈下降趋势，并出现红褐色结块，表明该菌的最佳生长温度为28 ℃。

2.2.3 pH对菌株GR01生长的影响

如图3C所示，本菌株在初始pH为4.0～10.0的环境下均可以生长，适宜生长pH为6.0～9.0，在pH等于8.0时，A660nm有最大值0.85，pH过高或者过低都会抑制其生长。所以，菌株GR01的最佳pH为8.0。

2.2.4 盐度对菌株GR01生长的影响

如图3D所示，菌株GR01培养基在盐度为5‰～50‰范围内都可以生长，适宜盐度范围为5‰～40‰，最佳盐度为10‰，高于或者低于10‰，本菌株生长速度下降。试验表明菌株GR01具有广盐性，对盐度适应性强。

2.3 氮磷去除能力的研究

2.3.1 光合细菌对氨氮的去除

光合细菌室内模拟去除水体中氨氮的趋势如图4A所示。

光合细菌投入水体中4 d后，试验水体氨氮含量极显著(P<0.01)低于对照水体中的氨氮含量；光合细菌投入水体10 d时，测定氨氮含量由初始的1.71 mg/L降至0.73 mg/L，去除效率为57.42%。

2.3.2 光合细菌对亚硝酸盐氮的去除

光合细菌室内模拟去除水体中亚硝酸盐氮的趋势如图4B所示。光合细菌投入养殖水体中2 d后，试验水体中亚硝酸盐氮含量显著(P<0.05)低于对照水体中亚硝酸盐氮含量；光合细菌投入养殖水体中4 d后，试验水体中亚硝酸盐氮含量极显著(P<0.01)低于对照水体中亚硝酸盐氮含量；光合细菌投入水体10 d时，测定亚硝酸盐氮含量由初始的0.33 mg/L降至0.24 mg/L，去除效率为28.74%。

2.3.3 光合细菌对总氮的去除

光合细菌室内模拟去除水体中总氮的趋势如图4C所示。从光合细菌投入养殖水体的2 d后，试验水体中总氮含量极显著(P<0.01)低于对照水体中的总氮含量；光合细菌投入养殖水体10 d时，测定总氮含量由初始的3.24 mg/L降至2.18 mg/L，去除效率为32.67%。

2.3.4 光合细菌对总磷的去除

光合细菌室内模拟去除水体中总磷的趋势如图4D所示。光合细菌投入养殖水体2 d后，试验水体中总磷含量极显著(P<0.01)低于对照水体中总磷含量；光合细菌投入养殖水体10 d时，测定总磷含量由初始的0.34 mg/L降至0.23 mg/L，去除效率为32.85%。

3 讨论

3.1 菌株GR01的分离鉴定与培养条件优化的研究

本研究将半固体培养法与焦性没食子酸法结合从重庆潼南内循环流水养殖场分离得到一株光合细菌GR01，根据形态学观察，发现菌株GR01形态与《常见细菌系统鉴定手册》[15]中紫色非硫细菌科光合细菌形态描述基本一致，并且生理生化试验中碳源利用试验和无机电子供体试验与张德民[20]发现的红篓菌属细菌的生理生化试验结果也基本吻合，因此初步判断菌株GR01为紫色非硫细菌科红篓菌属。为进一步鉴定菌株的所属种，研究进行了细菌16S rDNA鉴定，结果表明GR01与北京红篓菌(FM177580、AM690346)的序列同源性较高，相似性高达99.8%。菌株GR01特征吸收光谱扫描结果符合《常见细菌系统鉴定手册》[15]中红篓菌属的描述，在798 nm处具有较低吸光度，与Rhodospirilum rubrum和Rc.centenaria[20]相似。因此，综合形态、生理生化试验、扫描吸收光谱和16S rDNA基因序列鉴定结果判定该菌株为北京红篓菌(Rhodocista pekingensis)。

温度是生物生长的重要因素，过高或过低都会抑制生物正常生长，根据黄雪娇等[21]的研究，当温度低于30 ℃时，前3 d水体中氨氮含量随温度升高而急剧下降，当温度为30 ℃～45 ℃，氨氮含量随温度升高而逐步下降，50 ℃时，水体中氨氮含量几乎没有变化。菌株GR01最适温度为28 ℃，适宜温度为20 ℃～36 ℃，在养殖高峰期的水温一般在25 ℃～30 ℃之间，适合光合细菌GR01生长。光合细菌大多生活在底泥中，根据底泥盐分的释放作用[22]，底泥中的盐度较高，因此光合细菌在生长中的盐度要求较高，培养时要注意提高培养基的盐度。菌株GR01的最适盐度为10，适宜盐度为5‰～50‰，可见菌株GR01具有较广的耐盐性，能够适应大部分淡水底质环境和海水养殖水体。根据中国渔业用水标准规定[23]，养殖淡水的适宜pH范围是6.5～8.5，海水pH范围是7.0～8.5[23]。菌株GR01的最适生长pH为8.0，适宜生长pH为6.0～9.0，与渔业养殖用水pH基本相同，因此无论是海水还是淡水的pH都十分适合光合细菌生长。

3.2 光合细菌对氮磷去除能力的研究

3.2.1 光合细菌对氨氮的去除

氨氮是光合细菌在水体中可以直接利用的氮源，光合细菌吸收分解其可获得自身所需的能量。本实验投加菌株GR01第10天对试验水体中氨氮具有57.42%的去除效率。该试验中光合细菌对于氨氮的去除效率高于徐珊楠等[24]所使用的红假单胞菌属光合细菌第3天对高密度彭泽鲫养殖水体中氨氮的20%～30%的去除效率和丁海涛等[25]的红假单胞菌72 h对水华后蓝藻大量死亡造成的黑臭水体中氨氮的35.6%的去除效率，与万田英等[12]的光合细菌第10天对富营养化湖泊上覆水氨氮的52.8%的去除效率与林启存等[26]从甲鱼养殖水体富集分离筛选出一株光合细菌第5天对鱼塘水中氨氮具有57.38%的去除效率类似。根据对比，表明光合细菌对水体中氨氮具有较高的去除效率。

3.2.2 光合细菌对亚硝酸盐氮的去除

亚硝酸盐氮可以通过光合细菌所含有的亚硝酸盐还原酶进行反硝化作用还原为氮气从水体中去除。本试验投加菌株GR01第10天对试验水体中亚硝酸盐氮具有28.74%的去除效率。林启存等[26]从甲鱼养殖水体富集分离筛选出一株光合细菌第5天对鱼塘水中亚硝酸盐氮具有27.91%的去除效率；信艳杰等[10]使用红假单胞菌第7天对实验水体中亚硝酸盐氮具有20.12%的去除效率；刘芳等[27]从杭州养鱼塘水样及底泥样品中富集分离得到3株紫色非硫光合细菌HZ-3、HZ-4、HZ-5第5天对鱼虾养殖水体中亚硝酸盐氮分别具有81.81%、67.33%和97.79%的去除效率。根据对比，光合细菌对亚硝酸盐氮去除效率存在较大差异，本研究中菌株GR01对亚硝酸盐氮的去除效率处于一般水平，对水体中亚硝酸盐氮的去除具有一定的使用价值。

3.2.3 光合细菌对总氮的去除

总氮是水中各种形态无机和有机氮的总量，包括氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮等无机氮和蛋白质、氨基酸和有机胺等有机氮。本试验投加菌株GR01第10天对试验水体中总氮具有32.67%的去除效率。徐栋[28]从南四湖底泥中分离得到的荚膜红细菌GH-5和球形红细菌GH-12第5天对总氮分别具有66.8%和62.1%的去除效率；林启存等[26]从甲鱼养殖水体富集分离筛选出一株光合细菌第5 天对鱼塘水中总氮具有45.34%的去除效率；万田英等[12]的光合细菌第10天对富营养化湖泊上覆水中总氮具有20.5%的去除效率。根据对比，光合细菌对水体中总氮的去除效率相对较低，这是由于光合细菌更倾向于利用水体中的无机氮，对水体中有机氮的利用效率相对较低。

3.2.4 光合细菌对总磷的去除

光合细菌在分解氨氮等物质的同时，会吸收水体中的聚磷酸盐从而达到去除磷的效果。本实验投加菌株GR01第10 天对试验水体中总磷具有32.85%的去除效率。试验中光合细菌对于总磷的去除效率高于陈丽媛等[29]的研究中所使用的红假单胞菌第5天对于总磷22%、15%的去除效率，低于王萍等[30]的研究中光合细菌PSB组对废水中总磷56.4%的去除效率和秦宇胜等[31]从北京城市河道水体中分离得到中光合细菌对于总磷42.21%的去除效率。根据对比表明菌株GR01对于水体中总磷的去除效率较高。

4 结论

经过鉴定，菌株GR01为北京红篓菌(Rhodocistapekingensis)；最适温度为28 ℃，最适pH为8，最适盐度为10‰，适应生活于温度较高的淡水和海水中；室内模拟对内循环流水养殖池塘净化区水体中氨氮、亚硝酸盐氮、总氮和总磷的去除率分别为57.42%、28.74%、32.67%和32.85%。本研究通过室内模拟在净化区水体加入光合细菌，发现光合细菌对净化区水体具有较好的净化作用，与内循环流水养殖模式的吸污系统结合，能有效提高净化区域的净化能力，完善内循环流水养殖系统的运行，改善养殖水体环境，从而达到生态养殖的目的，为光合细菌在内循环流水养殖模式中的应用提供数据支持。

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