番茄叶片及果实总RNA 提取方法的比较

郭荔雯 ，摆福红 ，沙晓东 ，张风琴 ，王 林，王晓敏 ，2，3，4

（1.宁夏大学农学院，银川 750021；2.宁夏设施园艺（宁夏大学）技术创新中心，银川 750021；3.宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室，银川 750021；4.宁夏现代设施园艺工程技术研究中心，银川 750021）

番茄（Solanum lycopersicum）属茄科一年生或多年生草本植物，是现代分子生物学研究中的一种重要模式植物［1］。在番茄分子生物学研究时，需从番茄叶片和果实中提取纯度高、完整性好的RNA，但由于其组织中积累了大量的次生代谢物质，如蛋白质、多糖和多酚等物质易与RNA 共沉淀，对RNA 的提取和纯化有干扰作用，进一步影响总RNA 的产量和质量［2］。目前，番茄总RNA 的提取方法有CTAB法、异硫氰酸胍法、Trizol 法及试剂盒法等，不同提取方法对于同一组织材料提取的差异较大［3，4］，因此对于植物不同组织或同一组织不同时期的总RNA 提取方法的比较显得尤为重要。

本研究以番茄品种Money maker（MM）为材料，分别采用Trizol 法、Trizol 改良法和试剂盒法（提叶片用OMEGA 试剂盒，提果实用华越洋试剂盒）共3 种方法分别提取番茄叶片和不同时期果实的总RNA，从RNA 浓度、纯度、完整性、成本等方面筛选出提取番茄叶片和果实总RNA 的最佳方法，以期为后续相关基因的表达及功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为MM，种植于宁夏大学北校区温室，进行常规化管理，叶片于五叶期进行采样，果实在青果期、转色期以及成熟期分别采样，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

叶片和不同时期果实总RNA 提取的试剂盒法分别为OMEGA 试剂盒与华越洋试剂盒。

1.2.1 OMEGA 试剂盒法 操作参照植物RNA 提取试剂盒（美国OMEGA 公司）的说明书进行。

1.2.2 Trizol法 操作参照马敬等［5］的方法进行。

1.2.3 Trizol 改良法 操作参照谭丽丽等［1］的方法，不同之处在于取0.1 g 番茄叶片液氮研磨成细粉后加0.1 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）继续研磨，液氮挥发后，迅速加入Trizol 试剂，在RNA 沉淀前再加入等量的苯酚∶氯仿∶异戊醇（PCI）=25∶24∶1，重新抽提1次。试验过程中加入的试剂都需预冷。

1.2.4 华越洋试剂盒法 操作参照华越洋（北京华越洋）试剂盒的说明书进行。

1.3 总RNA 质量检测

取2 μL RNA 溶液，利用核酸蛋白检测仪检测RNA 样品浓度和OD值。一般情况下，RNA 样品的OD260/OD280比值低于1.8 证明有蛋白质和酚类等杂质的污染；而高于2.0 证明有异硫氰酸残留等或RNA有一定降解，所以纯度较高的RNA其OD260/OD280值 应 在 1.80～2.00。 RNA 的OD260/OD230值 应 大 于2.00，若小于2.00 表明样品被小分子物质或有机溶剂污染［6，7］。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性：取5 μL RNA 样品，点样于1%琼脂糖凝胶（每100 mL凝胶含有 10 μL GelRed）点样孔中，140 V 恒压电泳15 min，在凝胶成像仪下观察并照相记录。琼脂糖凝胶电泳主要用来检测RNA 的完整性，总RNA 样品的主要成分是28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA；从电泳结果的28S rRNA 和18S rRNA 的完整性来判断RNA 样品有无降解以及降解程度［7］。完整性好的RNA 经琼脂糖凝胶电泳后，其28S rRNA 与18S rRNA 条带的亮度比例约为2∶1。若发生部分降解，一方面28S rRNA 会降解为18S rRNA，导致二者比例的改变；另一方面28S rRNA 与18S rRNA 降解为更小的片段，导致RNA 条带拖尾；若发生彻底降解，则RNA 在泳道内呈弥散状，无任何条带。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取番茄叶片总RNA 的纯度及浓度的比较

由表1可知，Trizol法、Trizol改良法和OMEGA试剂盒法3种方法提取的番茄叶片总RNA的OD260/OD280分别为 1.92、1.97 和 1.99，均在 1.80～2.00，说明 3 种方法提取的RNA 均未受DNA、蛋白质和酚类物质的污染；且3 种方法的OD260/OD230均大于或等于2.00，说明3 种方法提取的RNA 基本未受小分子物质和盐类污染，表明3 种方法提取的番茄叶片总RNA 纯度均符合基本要求。从浓度分析可得，OMEGA 试剂盒法提取的总RNA 浓度最高，为2 560 ng/μL，Trizol 改良法和 Trizol 法次之，分别为 2 096、2 080 ng/μL。因此，对于番茄叶片，3 种方法提取的RNA纯度与浓度都能达到后续分子生物学研究的需求。

表1 3 种方法提取番茄叶片总RNA 的纯度及浓度比较

2.2 不同方法提取番茄叶片总RNA 凝胶电泳检测

经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）显示，3种方法提取的番茄叶片总RNA 均有28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3 个条带，且泳道内均无明显弥散拖尾现象，表明其基本不存在降解。OMEGA 试剂盒法提取的番茄叶片总RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 两条带亮度比值约为1∶1，表明其完整性一般；Trizol改良法提取的28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值近似为2∶1，完整性最好；Trizol 法的条带清晰度较其他2种方法差，28S rRNA 和18S rRNA 亮度比值约为1∶1。综上所述，Trizol 改良法提取效果比OMEGA试剂盒法提取的RNA 更好。

图1 3 种方法提取番茄叶片总RNA 琼脂糖凝胶电泳检测

2.3 不同方法提取番茄果实总RNA纯度及浓度比较

由表2可知，对于青果期的番茄果实，华越洋试剂盒法和Trizol改良法提取的果实总RNA的OD260/OD280均在 1.80～2.00，而 Trizol 法OD260/OD280小于 1.80，说明受到少量DNA、蛋白质和酚类物质的污染。但华越洋试剂盒提取的果实总RNAOD260/OD230大于2.00，表明其纯度最好。其他2 种方法OD260/OD230低于1.00，说明受到大量小分子物质和盐类的严重污染，导致二者纯度均较差。Trizol 法提取的RNA 浓度最低（271 ng/μL），Trizol 改良法与华越洋试剂盒法提取的RNA 浓度相当，后者略高（317 ng/μL）。

对于转色期的番茄果实，华越洋试剂盒法提取的番茄果实总RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230分别为1.98和2.24；其他2种方法OD260/OD280均小于1.80，说明RNA 受到少量DNA、蛋白质和酚类物质的污染，OD260/OD230略低于2.00，说明受到少量小分子物质和盐类的污染。3 种方法所提取的RNA 浓度相当，依次为351、362、377 ng/μL。

对于成熟期的番茄果实，华越洋试剂盒法和Trizol 改良法所提取总RNA 的OD260/OD280分别为1.92和1.91，OD260/OD230分别为2.11和2.03，说明两者纯度均较高，而Trizol法OD260/OD280为1.70，OD260/OD230为1.38，说明该方法提取的RNA 受各种杂质污染比较严重。3 种方法所提取的RNA 浓度相当，分别为328、332、348 ng/μL。

表2 3 种方法提取番茄果实总RNA 的纯度及浓度比较

2.4 不同方法提取果实总RNA 凝胶电泳检测

2.4.1 青果期番茄果实总RNA 凝胶电泳检测 3 种方法提取的青果期果实总RNA 样品经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，华越洋试剂盒法和Trizol 法提取的总RNA 有明显的28S rRNA 和18S rRNA 条带，且无弥散，二者亮度比值均为1∶1，完整性较好。而Trizol 改良法提取的总RNA 条带不够清晰，无明显的28S rRNA 和18S rRNA 条带，且有弥散，表明完整性差。综合而言，华越洋试剂盒法对番茄青果期总RNA 的提取效果最好（图2）。

图2 3 种方法提取青果期番茄果实总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

2.4.2 转色期番茄果实总RNA 凝胶电泳检测 3 种方法提取的转色期果实总RNA 样本经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，Trizol 法提取的总RNA 的28S rRNA 和18S rRNA 条带不清晰，说明存在严重的降解；而Trizol 改良法、华越洋试剂盒法提取的总RNA条带较清晰，28S rRNA 和18S rRNA 条带亮度比值均接近于2∶1，说明RNA 的完整性好。所以，Trizol改良法和华越洋试剂盒法对转色期番茄总RNA 的提取效果均好（图3）。

图3 3 种方法提取转色期番茄果实总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

2.4.3 成熟期番茄果实总RNA 凝胶电泳检测 3 种方法提取成熟期果实总RNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，华越洋试剂盒法和Trizol 改良法提取的总RNA 均有明显的28S rRNA 和18S rRNA 条带，Trizol 改良法的 28S rRNA 和 18S rRNA 条带亮度比值接近于2∶1，说明该方法提取的成熟期番茄果实RNA 的完整性较好；Trizol 法提取的总RNA 28S rRNA 和18S rRNA 条带不明显，存在大量降解，完整性差。综合而言，Trizol 改良法适合成熟期番茄果实总RNA 的提取（图4）。

图4 3 种方法提取成熟期番茄果实总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

2.5 耗时与成本比较

通过对番茄叶片和不同时期果实总RNA 提取成本和耗时比较可知（表3），试剂盒法耗时最短（40 min），但成本较高（17.2 元/个、14.8 元/个）；Trizol 改良法成本次之（5.5 元/个），但耗时最长（75 min）；Trizol 法成本最低（4.8 元/个），耗时较长（65 min）。说明试剂盒法具有高效的提取特点，能快速地从番茄叶片及果实中提取到较高质量的RNA，且提取过程操作简单。Trizol改良法成本低，耗时长，提取效果较好，Trizol法成本虽然最低，但是提取的效果较差。

表3 RNA 提取方法成本与成本的比较

3 讨论

完整性好、纯度高的RNA 在基因克隆及表达分析等分子生物学研究中发挥着至关重要的作用［8］。目前已有多种植物RNA 提取分离的报道，但不同植物其组织成分不同，适用的有效提取方法也不同，同一植物组织的RNA 提取效果也有明显差异［9］，尤其是番茄果实中含有多糖、多酚和蛋白质等物质，如何去除这些物质对番茄果实提取到有效的RNA 有一定的影响［10］。

在试验中，对于番茄叶片总RNA 的提取而言，3种方法均适用，其中OMEGA 试剂盒法所提取的总RNA 浓度最高，但电泳条带中28S rRNA 和18S rRNA 的亮度没有明显的 2∶1 比例，而 Trizol 改良法提取的总RNA 的浓度次之，但电泳条带中28S rRNA和18S rRNA 的亮度比值约为2∶1，完整性最好。分析造成上述问题的原因可能是在操作过程中对杂质的去除不够彻底，也有可能是在琼脂糖凝胶电泳时RNA 有所降解，所以提取番茄叶片总RNA 效果最好的是Trizol改良法。

对于青果期及转色期果实总RNA 的提取而言，华越洋试剂盒法提取总RNA 的效果最好，纯度和浓度均最高，但成本也最高。虽然Trizol 改良法所提取的转色期果实总RNA 凝胶电泳条带的28S rRNA与 18S rRNA 亮度比值约为 2∶1，但是OD260/OD280为1.72，低于1.80，说明纯度不够好，RNA 受到较多的DNA、蛋白质和酚类物质的污染。对于成熟期果实而言，华越洋试剂盒法提取效果最好，但成本最高；而Trizol 改良法的提取效果次之，但成本低，若在考虑成本的基础上，Trizol 改良法更适于提取成熟期果实的RNA。其中，试剂盒法的提取操作较简单，耗时短，但成本最高（提取番茄叶片的为OMEGA 试剂盒，提取番茄果实的为华越洋试剂盒）；Trizol 改良法较Trizol 法而言，Trizol 改良法的所有操作均需在冰盒上进行，且操作步骤较多，耗时更长。除此之外，不同时期果实用同种方法提取出RNA 的效果也有所不同，分析可能是由于不同时期的番茄果实中多糖、多酚及蛋白质等物质的含量有所不同，尤其是成熟期的果实多糖及多酚的含量更高，而上述物质易与RNA 共沉淀，对RNA 的提取和纯化有干扰作用，进一步影响总RNA 的产量和质量。因此，即使目前有关提取RNA 方法的报道很多，但对特定的植物组织而言，需根据具体情况做适当的调整，尽可能地减少RNase对核酸的干扰，进而保证提取RNA的效果。

综合来看，试剂盒法最适宜于番茄青果期果实及转色期果实高质量RNA 的提取，Trizol 改良法最适宜于番茄叶片及成熟期果实高质量RNA 的提取，为后续的基因克隆、mRNA 表达分析、cDNA 文库建立及原位杂交等分子生物学试验奠定了基础。