云浮地区肺结核病患者结核分枝杆菌复合群耐药性分析

林小玲， 梁立锋， 吴影桃， 赵杰明， 蔡秋月

（1.罗定市人民医院检验科，广东 云浮 527200；2.云浮市慢性病防治中心检验科，广东 云浮 527300；3.云浮市慢性病防治中心结核病防治科，广东 云浮 527300）

结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，传染性强。我国是结核病高负担国家，近年来的流行病学调查结果显示，我国肺结核病的发病率越来越高，耐药情况也相当严重，已逐渐呈现出高感染率、高发病率、高耐药率、高死亡率等特点[1-3]，尤其是耐多药和广泛耐药结核病，已经成为结核病防治的挑战性难题[4]。另外，非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）感染也较常见，发病率也呈逐年上升趋势[5]，患者发病症状、影像学检查及痰涂片镜检与肺结核病易混淆，常导致误诊。鉴于各地区结核病疫情特点的不同[6]，为了解云浮地区肺结核病流行状况及耐药特点，以便制定有效、合理的治疗方案，本研究分析了云浮地区近3年MTBC的耐药情况。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2016—2019年分离自云浮市区及云安区、新兴县、罗定市和郁南县5个慢性病防治机构结核病门诊确诊结核病初诊患者痰培养阳性菌株1 571株，患者男1 158例、女413例，年龄14～92岁。MTBC标准菌株H37Rv由广东省结核病控制中心提供，冷冻保存。

1.2 仪器和试剂

HR40-ⅡA2型生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司），450型CO2培养箱（上海精密实验设备有限公司），22 SWG标准接种环（广州市尤德生物科技有限公司）。改良中性罗氏培养基、酸性罗氏培养基、500 μg/mL对硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）培养基以及9种含药培养基，9种含药培养基分别为4种一线抗结核病药物培养基（异烟肼0.2 μg/mL、利福平40 μg/mL、链霉素4 μg/mL、乙胺丁醇2 μg/mL）、5种二线抗结核病药物培养基（氧氟沙星2 μg/mL、卡那霉素30 μg/mL、丙硫异烟胺5 μg/mL、对氨基水杨酸2 μg/mL、卷曲霉素40 μg/mL），购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTBC分离、培养 将痰样本用4%NaOH溶液处理后，分别接种于4支酸性罗氏培养基，培养8周，培养物涂片染色确定为抗酸菌后，纳入本研究的病例菌株。

1.3.2 MTBC鉴别试验 以PNB培养基作为鉴别培养基，将入选菌株同时接种于空白改良中性罗氏培养基（空白对照培养基）和PNB培养基，空白对照培养基生长而PNB培养基不生长，即为MTBC；在空白对照培养基和PNB培养基上都生长，即为NTM。具体操作步骤参照《耐多药肺结核防治管理工作方案》[7]与《结核病实验室检验规程》[8]进行。

1.3.3 体外药物敏感性试验 采用比例法进行菌株对9种抗结核病药物的体外药物敏感性试验，操作按照《结核病实验室检验规程》[8]进行。

1.4 质量控制

本结核病实验室由广东省结核病控制中心定期督导质控。MTBC菌群鉴别试验和体外药物敏感试验由经过培训的技术人员操作，并严格按照标准操作程序进行，均以H37Rv标准敏感菌株作为质控敏感对照，在含药培养基上均不生长。以空白对照培养基生长而PNB培养基不生长为MTBC菌群鉴别试验质控合格，否则重复试验，直至合格。空白对照培养基上菌落生长良好，且高稀释度对照培养基上菌落数≥20个，则体外药物敏感性试验质控合格，否则重复试验，直至合格。

1.5 统计学方法

采用Excel 2003软件进行数据分析，计数资料用率表示。

2 结果

2.1 MTBC鉴别试验结果

1 571株分枝杆菌临床分离株中，有1 514株（96.4%）被鉴定为MTBC，57株（3.6%）被初步鉴定为NTM。

2.2 体外药物敏感性试验结果

2.2.1 总体耐药情况 1 514株MTBC中，有237株（15.70%）存在不同类别的耐药，其中单耐药145株（9.60%）、多耐药57株（3.80%）、耐多药34株（2.20%）、广泛耐药1株（0.07%）。

2.2.2 MTBC对不同药物的耐药情况 237株耐药MTBC对一线抗结核病药物的耐药率从高到低依次为链霉素（11.2%，170株）、异烟肼（7.5%，114株）、利福平（3.7%，56株）、乙胺丁醇（3.4%，51株）；对二线抗结核病药物的耐药率从高到低依次为氧氟沙星（1.8%，27株）、对氨基水杨酸（1.5%，23株）、卷曲霉素和丙硫异烟胺（0.5%，7株）、卡那霉素（0.3%，4株）。

2.2.3 耐多药和广泛耐药菌株交叉耐药情况 耐多药菌株对一线抗结核病药物乙胺丁醇的耐药率最高（67.6%），对二线抗结核病药物氧氟沙星的耐药率最高（23.5%，8株），其次为卷曲霉素、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺，均为5.9%（2株），对卡那霉素的耐药率为0；仅有的1株广泛耐药菌株对一线和二线抗结核病药物均耐药。

2.2.4 耐多药和广泛耐药菌株耐药谱 耐多药菌株药耐谱中，一线抗结核病药物以异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇组合最为常见，耐药率高达41.2%；二线抗结核病药物以异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星组合最常见，耐药率为14.7%。1株广泛耐药菌株对所有药物均耐药。见表1。

表1 耐多药菌株耐药谱

3 讨论

结核病严重威胁公众健康，NTM的传染性虽不强，但同MTBC一样严重危害公众健康。NTM感染与MTBC感染在治疗上有较大差异，误治会对患者感染部位造成实质性损伤，极大影响NTM感染患者的预后[9]，所以NTM感染所致肺部疾病的准确诊断非常关键。本研究1 571株菌株中，分离出NTM 57株，检出率为3.6%，远低于全国平均水平（22.9%）[10]和邻近市——肇庆的12.34%[11]，与本地区所属省份——广东省的1.85%[12]和邻近市——茂名市的1.71%[13]相近，提示NTM分布存在地区差异。目前，结核分枝杆菌与NTM感染导致的结核病诊断金标准是罗氏培养法，因细菌生长缓慢，通常需4～8周才能出结果，无法满足临床需求。

耐药是结核病化疗失败的主要原因之一。本研究有237株MTBC耐药菌株，总耐药率为15.7%，低于全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示的42.1%[10]，也低于广东省（21.93%）及珠海市和茂名市的总耐药率（19.74%、18.25%）[12-14]，提示本地区MTBC耐药水平较低。

体外药物敏感性试验结果显示，本地区MTBC主要以单耐药为主，耐2种及以上药物菌株所占比例较小，其中单耐药、耐多药、多耐药菌株的耐药率分别为9.60%、3.80%、2.20%，较全国的16.50%、31.60%、11.70%低，与广东省[12]的12.90%、5.82%、2.99%相近。本地区广泛耐药率（0.07%）比全国（2.10%）及广东省（0.34%）低，提示本地区总耐药和各类型耐药水平均接近或低于全国和本省水平，但仍需提高初诊患者的治疗质量，从源头上减少耐药的产生。本研究广泛耐药病例虽仅有1例，但提示本地区已存在广泛耐药结核病患者，应加强监测，防止扩散传播。

本研究结果显示，云浮地区的结核病患者对一线抗结核病药物链霉素和异烟肼耐药最严重，与全国及广东省的情况相符，可能与以前肺结核病治疗方案以链霉素+异烟肼组合为主有关。因此，临床在制定化疗方案时，对链霉素+异烟肼的使用应慎重。本研究中，菌株对二线抗结核病药物氧氟沙星和对氨基水杨酸的耐药率最高，异于广东省（氧氟沙星和卷曲霉素）和茂名市（对氨基水杨酸和卡那霉素），提示不同地区MTBC耐药情况有所不同，临床医生应根据当地菌株的耐药特点制定合理的治疗方案。本地区结核病患者对氟喹诺酮类药物（氧氟沙星）的耐药率最高，可能与其本身为广谱抗菌药物，基层医务人员在日常诊疗过程中过早使用该药物有关。因此，对于不明原因的感染或肺结核病合并肺部感染的患者，应合理使用喹诺酮类药物，避免因耐药影响治疗。

耐多药和广泛耐药是结核病药物治疗面临的严重挑战。耐多药是菌株至少同时对异烟肼、利福平耐药；广泛耐药是菌株对异烟肼、利福平耐药，同时对任何氟喹诺酮类药物耐药，以及至少对1种二线抗结核病药物（卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）耐药。本地区耐多药菌株对一线抗结核病药物乙胺丁醇和链霉素的耐药率分别为67.6%和52.9%，提示本地区耐多药菌感染治疗在一定程度上主要依靠二线抗结核病药物。本研究中，菌株对二线抗结核病药物卡那霉素的耐药率最低，建议临床予以关注；菌株对卡那霉素、卷曲霉素的耐药率不高，可用于组成耐多药治疗方案；对氨基水杨酸、丙硫异烟胺也可作为制定耐药方案所选择的药物，但因其本身属于抑菌药物，对结核病的治疗作用有限。

本研究中，MTBC耐药谱构成呈现出多态性和复杂性。耐多药谱共11种组合，其中异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇（41.2%）与异烟肼+利福平+链霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星（14.7%）组合最为常见，因此在制定耐多药治疗方案时，特别是制定标准化治疗方案时，应充分考虑菌株对这几种药物的耐药情况，调整治疗方案。

本研究中，虽然广泛耐药菌株仅有1株，但提示其已经产生或开始传播，可能对本地区结核病防控形成威胁，广泛耐药结核病不但抗药性更强，治疗上比耐多药结核病更为困难，早发现和积极防控是关键。

综上所述，本地区MTBC耐药谱的多态性和复杂性，一方面提示耐药成因复杂，另一方面也在一定程度上提示标准化治疗方案可能难以覆盖足够的耐药谱型，应开展体外药物敏感性试验，尤其是开展耐药分子生物学检测，根据检测结果设计个体化治疗方案应成为耐药结核病治疗的首选。