内蒙古籽用西葫芦病毒病病原鉴定

岳建英，韦学锋，郑红丽，李正男，赵明敏

(内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010019 )

籽用西葫芦(CucurbitapepoL.)属葫芦科南瓜属作物[1]，是一种以取食籽粒为主的内蒙古特色经济作物[2]。由于其籽粒含有丰富的维生素、蛋白质、胡萝卜素和矿物质等营养成分，因而在我国广泛种植[3]。随着种植面积不断增加，籽用西葫芦病害发生日趋严重[4]，尤其是病毒引起的花叶病，已成为制约籽用西葫芦种植产业发展的主要因素[5]。

据报道，目前国内外能侵染葫芦科作物的病毒有89种[6]，其中马铃薯Y病毒属(Potyvirus)所占比例最多，为18.6%[7]。马铃薯Y病毒属中最常见、危害最为严重的有小西葫芦黄化花叶病毒 (Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papayaringspotviruswatermelonstrain,PRSV-W)[8]。不同病毒复合侵染是引起西葫芦花叶病的主要原因[9]，常造成严重的经济损失[10]。在法国和黎巴嫩地区侵染西葫芦的病毒主要有小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)、南瓜蚜传黄化病毒(Cucurbitaphid-borneyellowsvirus,CABYV)、南瓜花叶病毒(Squashmosaicvirus,SqMV )和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)[11]。在美国俄克拉荷马州葫芦种植区，主要检测到番木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV )、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)[12]。在我国山东地区葫芦科蔬菜上主要检测到烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和CMV等[13]，在新疆石河子及新湖籽用西葫芦上主要检测到CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W的侵染[14]，在重庆地区黄瓜上检测到CMV、SqMV、芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)、WMV、ZYMV 5种病毒[15]，在云南建水西葫芦上检测到ZYMV[16]，在甘肃河西地区瓜类作物上检测到WMV、CMV、ZYMV、PRSV-W和SqMV-W[17]。

近年来，籽用西葫芦花叶病在内蒙古自治区西部地区大面积发生，减产达80%以上，部分田块甚至全田绝收，引起严重的经济损失。籽用西葫芦花叶病在田间的症状为系统性花叶和斑驳，叶脉深绿；西葫芦畸形，表面色泽不均一，呈深绿斑驳和突起，有深绿花斑。本研究通过sRNA深度测序技术和RT-PCR技术，对内蒙古土默特左旗侵染西葫芦的花叶病病原进行鉴定，为籽用西葫芦花叶病的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在内蒙古土默特左旗籽用西葫芦田间采集7份具有典型花叶症状的叶片和健康西葫芦叶片，分别装在干净的自封袋中，经液氮速冻后于-80 ℃保存。选择花叶症状严重的2份样品用于本研究，并分别命名为Z1和Z2。

1.2 籽用西葫芦样品总RNA的提取

将Z1、Z2样品和健康西葫芦叶片分别在液氮中充分研磨，取100 mg样品装于1.5 mL无酶离心管，用 TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取籽用西葫芦样品的总RNA，操作步骤参照TRIzol试剂使用说明书进行。经检测总RNA质量达到了建库要求。

1.3 文库的构建和测序

按照small RNA Sample Pre Kit ( Illumina)说明进行文库构建。文库构建后使用Illumina HiSeq4000平台测序获取原始数据。利用生物信息学分析法去除带接头和低质量、短于18或长于35个核苷酸序列的reads以及不能确定的碱基数大于10%的reads，获得Clean reads。采用Bowtie软件[18]对sRNA进行分类注释，过滤掉rRNA、tRNA及重复序列；利用Velvet软件对sRNA进行拼接，然后在数据库(GenBank Virus RefSeq、GenBank Virus RefSeq、NCBI NR、NCBI NT)中比对以获得病毒信息。

1.4 籽用西葫芦花叶病病毒的RT-PCR鉴定

根据NCBI发表的WMV和ZYMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计引物(表1)，用于RT-PCR检测和验证sRNA测序结果，以健康的西葫芦植株作为阴性对照。以总RNA为模板，按照GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒(Promega)的操作说明进行逆转录生成cDNA第一链。用合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，用ddH2O补足25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃(CMV)、50 ℃(ZVMV)、50 ℃(WMV)或58 ℃(CLLV)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收并纯化目标产物。根据试剂盒说明将产物连接到pTOPO-T载体(北京艾德莱生物技术有限责任公司)上，挑取阳性克隆进行测序。

表1 RT-PCR检测所用引物Table 1 Primers for detection of viruses by RT-PCR assay

1.5 数据处理与分析

将1.4节测序结果与已发表的侵染西葫芦的WMV和ZYMV外壳蛋白序列用SDTv2.1软件进行Blast比对，采用Vector NTI 11软件进行碱基序列拼接处理，应用SDTv2.1软件进行碱基序列一致性分析，利用MEGA 6.0软件中的N-J法[19]构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 内蒙古籽用西葫芦花叶病的田间症状

内蒙古土默特左旗籽用西葫芦花叶病的田间症状表现为系统性花叶和斑驳，叶脉深绿；西葫芦畸形，表面色泽不均一，呈深绿斑驳和突起，有深绿花斑(图1)；发病瓜后期变软，不结籽或结籽率非常低。

图1 内蒙古籽用西葫芦花叶病的田间症状Fig.1 Mosaic symptoms in leaves and zucchini in field in Inner Mongolia

2.2 籽用西葫芦花叶病的sRNA深度测序结果

籽用西葫芦sRNA深度测序后共获得15 800 209条reads原始数据，去除带接头和低质量、短于18或长于35个核苷酸序列的reads以及不能确定碱基数大于10%的reads后，得到15 241 618条Clean reads(占总reads的96.46%)。利用Velvet软件对sRNA进行拼接后在数据库中比对共注释到14种病毒(表2)，其中WMV拼接到204条contigs，含有708 908条reads(28.21%)；ZYMV拼接到71个contigs，含有1 731 846条reads(68.92%)；CMV共拼接到47个contigs，含5 235条reads(0.21%)；SMV拼接到6个contigs，含有27 246条reads(1.08%)；CLLV拼接到4个contigs，共有17 991条reads(0.72%)；WVMV拼接到3个contigs，含有10 285个reads(0.41%)；sRNA测序所检测到的其余8种病毒仅匹配上1个contig，因此认为可能是假阳性。

表2 籽用西葫芦花叶病的sRNA深度测序结果Table 2 sRNA deep sequencing results of zucchini mosaic disease

2.3 籽用西葫芦花叶病病毒的RT-PCR检测

为验证sRNA测序分析结果，根据Genbank已发表的侵染西葫芦的病毒外壳蛋白基因序列设计相应引物，分别以Z1和Z2总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩增。结果表明，在Z1和Z2 2个样品中均扩增到ZYMV(283 bp)和WMV(485 bp)特异性条带(图2)，同时，也扩增到了CMV(345 bp)和CLLV(315 bp)的特异性条带。扩增获得的SMV和WVMV片段经测序后发现，其序列与WMV完全一致。可能是SMV和WVMV这2个病毒与WMV序列相似度较高，且在样品中含量较低，导致引物优先结合到WMV模板上。

M.DNA Marker；1.健康植物；2.Z1样品；3.Z2样品M.DNA Marker;1.Healthy plant;2.Sample Z1;3.Sample Z2图2 籽用西葫芦花叶病病毒的RT-PCR检测Fig.2 RT-PCR detection of main virus in zucchini mosaic disease

2.4 籽用西葫芦花叶病病毒WMV和ZYMV的序列一致性和系统发育树分析

用SDTv1. 2软件对扩增产物序列与GenBank已发表的ZYMV、WMV序列分别进行一致性分析，结果如图3和图4所示。由图3和图4可知，2个籽用西葫芦样品中ZYMV分离物MK002236和MK002237的一致性为99.601%，与其他地区的ZYMV分离物序列一致性为98.601%～99.601%；2个籽用西葫芦样品中WMV的分离物MK015646和MK015645的一致性为94.401%，与其他地区WMV的分离物序列一致性为93.001%～96.101%。

1.意大利未知作物分离物 Unknown Italy (EU660590);2.法国甜瓜分离物 Melon France (JF273462);3.韩国人参分离物 Panax ginseng South Korea (KT992070);4.韩国人参分离物 Panax ginseng South Korea (KT992092);5.韩国未知作物分离物 Unknown South Korea (KU240107);6.韩国未知作物分离物 Unknown South Korea (KU240099);7.中国西葫芦分离物 Zucchiri China (MK015646);8.意大利柑橘分离物Citrullus lanatu Italy (FJ823122);9.法国未知作物分离物 Unknown Francle (EU660585);10.法国西葫芦分离物 Zucchini France (JF273458);11.法国西葫芦分离物 Zucchini France (FJ273460);12.法国未知作物分离物 Unknown France (EU660581);13.法国甜瓜分离物 Melon France (JF273469);14.中国西葫芦分离物 Zucchini China (MK015645);15.韩国人参分离物 Panax ginseng South Korea (KT992088)图3 籽用西葫芦花叶病WMV序列一致性分析Fig.3 Consistency analysis of WMV sequences in zucchini mosaic disease1.斯洛伐克西葫芦分离物 Cucurbita pepo Slovakia (DQ124239);2.捷克西葫芦分离物 Cucurbita pepo Czech Republic (KF976712);3.斯洛伐克西葫芦分离物 Cucurbita pepo Slovakia (KF976713);4.伊朗西葫芦分离物 Cucurbita pepo Iran (KU198853);5.以色列未知作物分离物 Unknown Israel (AY188994);6.以色列未知作物分离物 Unknown Israel (EF062582);7. 以色列未知作物分离物 Unknown Israel (EF062583);8.伊朗西葫芦分离物 Cucurbita pepo Iran (JN183062);9.中国西葫芦分离物 Zucchini China (MK002237);10.中国西葫芦分离物 Zucchini China (MK002236);11.伊朗蚜虫分离物 Aphis Zran (KU528623)图4 籽用西葫芦花叶病ZYMV序列一致性分析Fig.4 Consistency analysis of ZYMV sequences in zucchini mosaic disease

为了进一步明确2个籽用西葫芦样品中ZYMV和WMV分离物与GenBank库中已发表病毒分离物的亲缘关系，采用MEGA 6.0分别构建了WMV和ZYMV的系统发育进化树，结果(图 5和图 6)发现，2个籽用西葫芦ZYMV分离物(MK002236和 MK002237)均与伊朗蚜虫ZYMV分离物(KU528623)聚合在同一支；籽用西葫芦Z1样品WMV分离物(MK015646)与意大利柑橘WMV分离物(FJ823122)距离最近，而Z2样品WMV分离物(MK015645)则与法国甜瓜WMV分离物、法国未知作物WMV分离物、法国西葫芦WMV分离物以及Z1 样品(MK015646)WMV分离物和意大利柑橘WMV分离物形成一个大分支。

图5 11种ZYMV分离物CP蛋白的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of nucleic acids of CP for 11 ZYMV isolates

图6 15种WMV分离物CP蛋白的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of nucleic acids of CP for 15 WMV isolates

3 讨 论

病毒病是葫芦科蔬菜的重要病害，常引起西葫芦产量降低、品质变劣，严重时甚至导致绝产。本研究通过对内蒙古土默特左旗采集的具有典型花叶症状的籽用西葫芦样品进行分子鉴定，明确了其病原是以WMV、ZYMV、CMV和CLLV为主的多种病毒复合侵染。这与我国各地报道的西葫芦病毒病复合侵染的情况类似，其中CMV[20-21]、WMV[22]和ZYMV[23]在各地均有检测到。

sRNA深度测序是近年来常用的植物病毒检测技术，可通过直接分析寄主中sRNA，拼接出样品中的单一病毒或复合侵染病毒序列[24]，该技术已在许多植物未知病原鉴定中发挥了重要作用[25]。本研究中，籽用西葫芦sRNA经拼接和比对共注释到14种病毒，其中WMV、ZYMV、CMV 3种病毒所占比例较高。RT-PCR扩增也检测到了相应病毒外壳蛋白的特异性条带。对于CLLV来说，尽管contig数目仅为4个，但RT-PCR检测到了其特异性条带。可能是在sRNA建库时，CLLV的sRNA数量较少，导致拼接获得的contig数目较少，但该病毒仍然存在样品中，这也是sRNA测序技术的优势，即能够检测到较低含量的病毒。但也不排除假阳性的可能，如样品中也注释到的其他8种仅含有1个contig的病毒，笔者认为这些病毒的contig可能是s-RNA测序技术中的非特异性扩增导致。

根据获得的籽用西葫芦WMV和ZYMV分离物的CP序列，构建了系统发育进化树。结果发现2个籽用西葫芦ZYMV分离物(MK002236,MK002237)均与伊朗蚜虫ZYMV分离物(KU528623)聚合在同一支；Z1样品WMV分离物(MK015646)与意大利柑橘WMV分离物(FJ823122)距离最近，而Z2样品WMV分离物(MK015645)则与意大利、法国WMV分离物形成一个大分支。因此推测籽用西葫芦上的WMV和ZYMV最初可能是由媒介昆虫或人从其他作物上传播而来的，也可能是籽用西葫芦种子进口、国内调运而传播到本地的。