原发免疫性血小板减少症患者外周血CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 表达水平分析

陈 哲 张 灵 刘 洁 张 斌 高炳华

1.河北北方学院附属第一医院血液科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院检验科，河北张家口 075000

原发免疫性血小板减少症（immune thrombocy topenia，ITP）既往又称为特发性血小板减少性紫癜，是一种常见的出血性疾病，临床以皮肤黏膜出血为主，严重者可有内脏甚至颅内出血，患者可有明显乏力症状[1]。体液和细胞免疫介导的血小板过度破坏以及巨核细胞数量和质量异常导致血小板生成不足是ITP 疾病发生的重要机制[2]。有研究证实，细胞免疫紊乱在ITP 发病过程中具有重要作用，其中以自身反应性T 淋巴细胞活化最为关键[3-6]。T 细胞活化过程除受第一信号、协同刺激型号等调控外，还受到负性信号分子反馈调控。程序性死亡因子-1（PD-1）/PD-L1 属于B7/CD28 家族的一对负性共刺激分子，在T 细胞活化及免疫耐受中发挥重要的负性调节作用[7-10]。基于此，本研究通过检测ITP 患者CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 的表达，探讨PD-1 在ITP 发病中的作用，从而为ITP 的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）血液科2015 年12 月—2017 年12 月收治的100 例新诊断的ITP 患者纳入研究组，男36 例，女64 例；年龄23～68 岁，平均（42.59±6.35）岁。纳入标准：①符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016 年版）》[11]的诊断标准；②对本研究知情同意并签署知情同意书，配合治疗和随访。排除标准：①患有假性血小板减少、继发性血小板减少或先天性血小板减少症；②妊娠或哺乳期妇女；③合并造血系统疾病；④参与本次研究前30 d 内接受过血小板输注、糖皮质激素和丙种球蛋白治疗。

同期选取我院门诊体检的健康志愿者50 名作为对照组，男18 名、女32 名；年龄22～71 岁，平均（43.34±6.82）岁。两组年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 治疗方法

研究组给予0.15 mg/（kg·d）的地塞米松（厂家：辰欣药业股份有限公司；批号：1509 092211；规格：5 mg/支）静脉输注，1 次/d 或0.8 mg/（kg·d）的甲泼尼龙（厂家：辉瑞制药有限公司；批号：AT9833；规格：40 mg/支）静脉输注，1 次/d。病情好转后改为1 mg/（kg·d）泼尼松（厂家：浙江仙琚制药股份有限公司；批号：151124；规格：5 mg/片）顿服，一共连续治疗4 周。

1.3 观察指标

采集研究组及对照组治疗前后晨起空腹静脉血2 mL。采用流式细胞术检测CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 表达情况，鼠抗人CD45-PerCP-Cy5.5（批号：9247247）、CD3-APC（批号：561811）、CD4-FITC（批号：9239677）、PD-1-BV421（批号：565935）单克隆抗体均购自美国BD 公司，BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪来自美国BD 公司，流式分析软件为BD FACSDiva Software。

随访患者4 周，观察研究组治疗前后血小板计数及CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率的变化。按治疗效果将研究组分成3 个亚组[11]：完全反应组即治疗后血小板计数≥100×109/L 且没有出血；有效组即治疗后血小板计数≥30×109/L 并且至少比基础血小板计数增加2 倍且没有出血；无效组即治疗后血小板计数<30×109/L 或者增加不到基础血小板计数的2 倍或者有出血。血小板计数均检测2 次且两次间隔7 d，结果取平均值。然后比较3 个亚组间CD4+T 淋巴细胞表面PD-1阳性表达率的差异。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间及组内比较采用t 检验，计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后血小板计数比较

治疗前，研究组血小板计数低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。治疗后，研究组血小板计数较治疗前升高，但研究组仍低于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 两组治疗前后血小板计数比较（×109/L，）

表1 两组治疗前后血小板计数比较（×109/L，）

2.2 两组治疗前后CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较

治疗前研究组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。治疗后，研究组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率较治疗前降低，但研究组仍高于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表2。

表2 两组治疗前后CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较（%，）

表2 两组治疗前后CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较（%，）

注：PD-1：程序性死亡因子-1

2.3 不同治疗效果亚组间CD4+T 淋巴细胞表面PD-1阳性表达率比较

完全反应亚组共33 例，有效亚组共39 例，无效亚组共28 例。三组治疗前CD4+T 淋巴细胞表面PD-1阳性表达率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。治疗后，完全反应组和有效组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1阳性表达率均较治疗前降低，差异均有统计学意义（均P ＜0.05），无效组治疗前后CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。三组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），完全反应组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率低于有效组和无效组，有效组低于无效组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表3。

3 讨论

ITP 是一种临床常见的出血性疾病，约占全部出血性疾病的30%，该病发病率为（5～10）/10 万人口[12]。ITP 患者常有较为明显的出血症状，严重者可发生内脏出血或颅内出血，威胁生命；另一方面，目前该病无特效药物，治疗后易反复发作，因此需要进行长期维持性治疗，严重降低了患者的生活质量。

表3 不同治疗效果组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较（%，）

表3 不同治疗效果组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性表达率比较（%，）

注：与有效组比较（t=9.141，aP <0.001）；与无效组比较（t=13.810，bP<0.001）；与无效组比较（t=7.398，cP <0.001）。PD-1：程序性死亡因子-1

现在研究发现ITP 的主要发病机制是自身免疫失耐受所致体液免疫和细胞免疫异常，导致血小板破坏增加、生成减少[13-15]，其中自身T 细胞免疫失耐受起着重要的作用，主要表现在血小板自身抗原反应性T细胞过度增殖活化、调节性T 细胞数量及功能异常、辅助性T 细胞异常等。PD-1 即CD279，为CD28 超家族的成员，其缺乏近膜端半胱氨酸残基，因此常以单体形式主要表达在活化的T 细胞、B 细胞、单核细胞等表面，在维持淋巴细胞稳态方面起关键作用。PD-L1和PD-L2 是PD-1 的两个配体，PD-L1 主要在活化的T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肿瘤细胞广泛表达，而PD-L2 主要表达于树突状细胞表面[16-17]。目前许多研究表明，PD-1/PD-L1 是T 细胞重要的负性调控信号，一旦表达异常将会造成自身免疫调节失衡、免疫耐受被破坏[18]，与多种自身免疫性疾病的发生、发展密切相关，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等[19-20]。但目前关于PD-1 与ITP 的相关性研究仍较少。

本研究结果显示，ITP 患者CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），经糖皮质激素治疗后，ITP 患者血小板明显升高，但其仍低于对照组，CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性率明显降低，但其仍高于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。且本研究结果显示，治疗后完全反应和有效组CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性率明显降低，差异均有统计学意义（均P >0.05），而无效组PD-1 阳性率与治疗前比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），提示治疗反应越好者其治疗后CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 阳性率下降越明显，提示CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 的表达可能与ITP 患者体内的免疫失衡程度有关，其表达升高可能是机体自身的代偿性负反馈。本研究结果与常规理论推断自身免疫性疾病患者CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 比例应该会下降不符，但与Stefanski 等[20]关于ITP 患者的研究结果一致。Wang 等[21]研究显示新发ITP 患者CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 比例升高并且PD-1/PD-L1 升高与ITP 患者疾病活动程度之间有一定关系。也有许多关于其他自身免疫病的研究发现外周血CD4+T 淋巴细胞表面PD-1 比例升高，且与疾病的活动度可能相关，如系统性红斑狼疮等[19-20]。

综上所述，ITP 患者CD4+T 淋巴细胞表面PD-1表达增高，可能与ITP 患者体内的免疫失衡程度有关。糖皮质激素治疗能减低其表达，其降低水平与ITP 治疗反应程度有关。但鉴于ITP 发病机制的复杂多样性，因此该指标是否可以用作ITP 患者疾病发展程度及预后的评估尚需进一步深入研究。