三种花生根腐病菌间生物学特性及致病力的比较分析

李 莹，张竹青，王连刚，袁宗英，于建垒，于 静，张 霞，郭志青，许曼琳，宋新颖，何 康，迟玉成*

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.莱西市望城街道办事处农业服务中心，山东 莱西 266601；3.青岛市农业技术推广中心，山东 青岛 266071； 4.山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100)

花生(Arachishypogaea)是我国重要的油料与经济作物，是食用植物油和蛋白质的重要来源，其在国民经济发展和对外贸易中占据着不可或缺的地位。随着气候和种植模式的变化，花生病害逐年严重，俨然成为花生产业进一步发展的主要障碍，也是导致花生供不应求的重要原因。

花生根腐病是一种常发性病害，在生产上是最难以防治的土传病害之一。镰孢菌属(Fusarium)真菌是一类既可侵染植物又可在土壤内生存的兼性寄生真菌，是使农作物致病的重要病原菌[1-2]。在花生的整个生育期均可以进行侵染，播种后出苗前会导致芽和种子腐烂等现象；苗期感染会导致花生苗出现根腐、枯萎等情况；成株期通过破坏花生的维管束组织，影响花生进行正常的水分和营养等物质运输，从而导致根腐、茎腐、茎基腐等严重病害[3-4]。镰孢菌在感染花生后可在植株内寄生很长时间并且具有很强的隐蔽性。到发育后期，开始侵染花生荚果，导致花生品质出现下降，更严重时会出现籽粒腐烂并且产生有毒物质，对花生产量及品质产生极大影响，严重时造成减产20%以上[5]。由镰孢菌引起其他作物根腐病的情况也不乏报道，如大豆根腐病[6]、豇豆根腐病[7]、百合根腐病[8]、党参根腐病[9]及丹参根腐病[10]等。

对镰孢菌生长发育的研究将有助于了解其培养特性的差异，寻找培养过程的异质性指标，为进一步研究镰孢菌的致病机理提供相关依据[11]，同时，可以加快田间病害的病原菌鉴定。通过对镰孢菌致病力的差异分析，可有效鉴定强致病力菌株，加以重点防治，减轻花生根腐病的发生，提高花生的产量及品质。

1 材料与方法

1.1 供试材料

尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)和茄腐镰孢菌(Fusa-riumsolani)是实验室采集分离自花生根腐病的病原菌，由实验室保存。供试品种花育36号。

1.2 供试培养基

供试PDA、PDB培养基的配制参考方中达的方法[12]。

1.3 试验方法

1.3.1 镰孢菌培养与观察

① 固体培养及形态学观察：在PDA培养基上选取生长5 d的供试菌株，在菌落边缘打取6 mm的菌饼，有菌丝的一面紧贴培养基，分别接种到相应培养基上。25 ℃黑暗培养10 d。观察并记录镰孢菌的颜色、气生菌丝并拍照。实验重复3次。

② 液体培养及分生孢子计数：取直径6 mm菌饼6个分别接到40 mL PDB液体培养基中，于25 ℃的摇床中150 r/min培养5 d，使用无菌过滤布进行过滤，去除其中的菌丝和菌饼，得到孢子悬液。经4 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入ddH2O重新悬浮，经3次离心-悬浮，获得干净无杂质的孢子悬浮液。在显微镜下观察3种镰孢菌分生孢子的产生过程，观察孢子形态并统计三种镰孢菌孢子的大小，n=100，实验重复3次。按照上述方法获得孢子悬浮液，稀释100倍后在显微镜下使用血球计数板统计孢子数量。每次试验每个菌株设置3个重复，实验重复3次。

1.3.2 镰孢菌接种

① 胚轴接种法：挑选大小一致，颗粒饱满的花生种在蛭石中培育，放置于25 ℃黑暗条件下，种子萌发至胚轴生长达5 cm左右时，每株花生胚轴上接种一个菌饼，每个镰孢菌株至少接种6株，置于25 ℃条件下黑暗保湿培养5 d，每天观察其发病情况。实验重复3次。

② 浸根接种法：在温室中选取大小一致培养7 d的健康花生苗，每5株为一组，置于灭菌的罐头瓶中，每个罐头瓶中加入107个/mL浓度的孢子悬浮液200 mL，浸泡花生苗根部，置于25 ℃的摇床上80 r/min培育3 d，每日观察并记录花生的发病情况。实验重复3次。

③ 土壤接种法：按照上述方法获得孢子悬液，调到浓度1×107个/mL。在一次性杯子的1/3底层用灭菌土，中间层用孢子液拌土，上层为灭菌土。将消毒处理后的花生种置于上层灭菌土中，每个一次性杯子种一粒花生种，每5株为一个镰孢菌处理组，设3组镰孢菌处理，1组对照(不加孢子液)，待植株发病较为明显时拍照，重复3次。

2 结果与分析

2.1 镰孢菌在PDA培养基上的菌落形态

图1可知，F.oxysporum菌落呈圆形，产生很厚的白色气生菌丝，菌丝致密，在生长过程中边缘较为不规则，菌丝背面橙红色；F.proliferatum菌落呈圆形且中间部分出现气生菌丝断层，菌丝颜色由淡黄至灰白，菌落较为致密且边缘不规则，菌丝背面中心呈紫红色，外围淡黄色；F.solani菌落呈圆形，气生菌丝较薄且中间部分出现气生菌丝断层，菌落质地内圈较稀疏，外圈致密，边缘规则，菌丝背面有明显的菌丝圈，颜色由内到外逐渐变浅。现将这三种镰孢菌菌丝的形态特征归纳如表1。

表1 不同镰孢菌在PDA培养基上的菌落形态 Table 1 Colony morphology of Fusarium on the PDA

2.2 产孢过程及孢子形态

为了解镰孢菌的产孢过程，在显微镜视野中观察到菌丝分枝的顶端缢缩产生小型分生孢子(图2)。同时发现F.oxysporum的小型分生孢子一般无隔、单细胞，孢子大小(3.97～4.66)μm×(2.88～3.62)μm，大型分生孢子镰刀型，多数3隔，(12.51～43.68)μm×(2.92～5.05)μm；F.proliferatum的小型分生孢子1～2个隔，孢子大小(6.58～12.63)μm×(2.98～4.78)μm，大型分生孢子舟型，(22.36～45.83)μm×(3.58～5.02)；F.solani的小型分生孢子形态最大，小型分生孢子大小(8.84～15.60)μm×(2.97～4.94)μm，大型分生孢子镰刀型，(18.51～44.67)μm×(3.18～6.23)μm。

2.3 产孢量

按照1.3.1 ② 的方法，对三种镰孢菌进行了产孢量的测定，如图3所示，孢子含量分别为：(9.11±0.59)×107/mL、(6.68±0.77)×107/mL、(1.68±0.42)×107/mL；结果经新复极方差分析，三种镰孢菌的产孢能力存在极显著性差异(P<0.01)，且尖孢镰孢(A)>层出镰孢(B)>茄腐镰孢(C)。

2.4 镰孢菌侵染花生的致病力测定

2.4.1 菌丝块接种花生胚轴法测定镰孢菌致病力

图4所示，菌丝块接种的花生胚轴上长出白色的菌丝，胚轴变褐且发病范围分别为F.oxysporum2.3±0.3 cm、F.proliferatum2.0±0.2 cm、F.solani1.1±0.2 cm。经测量统计发病长度并新复极方差分析，结果表明，三种镰孢菌的菌丝块在花生胚轴上的致病力呈现显著差异(P<0.01)：尖孢镰孢(A)>层出镰孢(AB)>茄腐镰孢(B)。

2.4.2 孢子液浸根法测定镰孢菌致病力

如图5所示，F.oxysporum接种的花生苗侧根脱落，脱落的侧根呈腐烂状，主根颜色变成褐色；F.proliferatum接种后的花生侧根脱落，脱落的侧根颜色变褐，但未腐烂，主根颜色变成轻微褐色；花生苗接种F.solani后侧根脱落，脱落的侧根颜色变褐，但未腐烂，主根颜色轻微褐色，与F.proliferatum接种的变化差异不明显。对照组花生苗侧根完整无脱落，颜色正常。

2.4.3 孢子液拌土培育花生苗法测定镰孢菌致病力

在前述离体接种分析致病力的基础上，进一步分析活体上接种以确认是否会呈现相似的致病力结果。按照1.3.2 ③土壤接种法培养20 d后，接种镰孢菌的花生苗开始出现萎焉的症状，再经过2～3 d后症状明显加剧，花生苗都表现为叶片和茎枯萎，植株萎蔫；而对照组花生苗长势良好，叶片新鲜且充满活力，未现枯萎(图6)。通过剖析接种镰孢菌的花生根茎部，发现维管组织呈现出不同程度的褐变，严重程度表现为：尖孢镰孢>层出镰孢>茄腐镰孢。利用李迎宾等制定的三七根腐病分级标准[13]，对三种镰孢菌侵染花生后的病害进行分级统计，并获得病情指数分别为：尖孢镰孢(84%)>层出镰孢(76%)>茄腐镰孢(64%)。

3 讨 论

引起植物根腐病的镰孢菌种类繁多，牛世全等[14]发现引发黄芪根腐病的主要致病菌为尖孢镰孢菌(F.oxysporum)和茄腐镰孢菌(F.solani)；马铃薯根腐病的主要致病菌为尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、锐顶镰孢菌(F.acuminatum)及茄腐镰孢菌 (F.solani)[15-16]；近期报道当归根腐病的病原菌为燕麦镰孢菌(F.avenaceum)和锐顶镰孢菌 (F.acuminatum)[17]，玉竹根腐病的致病菌为锐顶镰孢菌(F.acuminatum)[18]。而对于花生根腐病的病原菌鉴定，实验室前期只鉴定到镰孢菌为优势菌群，未进行深入鉴定及分类研究[19]。本研究在已有基础上得到上述结果，明确了三种镰孢菌均能致病，并鉴定出优势菌株为尖孢镰孢菌。

三种接种方式鉴定镰孢菌致病力的方法存在各自优缺点。菌丝块接种胚轴的方法是最简便快速的，能有效区分致病力之间的差别，缺点是菌丝块接种只能侧面反映菌株致病力，对于能够产生分生孢子的病原菌而言，分生孢子的致病力分析才是最重要的。孢子液浸根接种法是最直接的，孢子直接接触花生根系，但缺点是致病力差异小的菌株之间不能明显区分开，像试验中层出镰孢菌和茄腐镰孢菌呈现的致病力差异不明显。土壤接种法是最接近田间病害发生的一种方法，但试验周期长。因此，分析病原菌致病力需综合多种方法才更能全面地反映病原菌的致病力。