基于生物信息学分析的TPX2在肺腺癌中的表达及意义

王庆亮，赵艳峰，蒋 燕，宋 晓，杨富钧，姜格宁

(同济大学附属上海市肺科医院胸外科，上海 200433)

目前肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌是最常见的一种病理类型[1]。随着人们对生物信息学、肿瘤基因组学的研究日益深入，基因靶向治疗用于治疗肺癌已成世界研究热点，寻找肿瘤细胞相关的关键调控基因已经成为攻克癌症的重要方向，具有重要的临床潜在利用价值[2]。

TPX2是由Wittmann等[3]于1998年首次在非洲爪蟾蜍卵发现的一种新型微管相关蛋白，被命名为XKlP2靶蛋白(targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)。该基因参与有丝分裂过程中中心体的成熟和纺锤体的形成[4]。研究发现，TPX2在许多癌症的组织中高表达[5-7]。但是TPX2在肺腺癌的研究中相关研究报道较少。本研究利用Oncomine、cBioportal、UALCAN、GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)、Kaplan-Meier Plotter以及OncoLnc数据库分析TPX2在肺腺癌中的表达和预后关系，以期为肺腺癌基因靶向治疗提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 Oncomine数据库

Oncomine数据库[8](https:∥www.oncomine.org/)是在线肿瘤微阵列数据库，用于确定肺腺癌中TPX2的转录水平。评估TPX2基因在肺腺癌中的共表达谱并显示为热图。提前使用邮箱注册Oncomine数据库账号，获取使用权限，随后根据研究需要，设定具体筛选的条件。本研究具体筛选条件如下。(1) gene条目:输入TPX2；(2) cancer type条目:选择CancervsNormal Analysis；(3) Cancer Type条目:选择Lung Cancer；(4) Analysis Type条目，P-VALUE设定0.0001，FOLD CHANGE=2，GENE RANK=10%；然后对数据库进行检索分析。

1.2 HPA数据库

人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)，简称HPA数据库[9](https:∥www.proteinatlas.org/)，是一个综合性人类蛋白质组学门户网站。使用26000多种高度特异性的抗体，采用免疫检测技术(免疫印迹、免疫荧光和免疫组化)，详细地检测了每种蛋白在76种细胞系、44种人类正常组织和17种肿瘤组织中的表达情况，该数据库提供了17000多种人类蛋白质在组织和细胞及血液中的分布信息。

1.3 UALCAN数据库

UALCAN网站[10](http:∥UALCAN.path.uab.edu/index.html)是一种交互式门户网站，网站数据主要来源是癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库。可以使用该数据库分析基因在肿瘤和正常样本中的差异性表达，同时可以比较不同肿瘤亚组临床病例特征，如肿瘤分期、病理亚型、肿瘤分子亚型、患者年龄、体重、吸烟史和种族等与基因表达的相关性，在本研究中使用该数据库分析TPX2 mRNA和肺腺癌患者临床病理特征的相关性。

1.4 cBioPortal数据库

cBio Cancer Genomics Portal数据库[11]提供了研究分析癌症相关基因数据的可视化工具，cBioPortal包含了多个数据库，比如TCGA数据库和国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)等共283项大型肿瘤相关基因表达和蛋白质组学的研究。cBioPortal可以通过可视化的形式展示癌症研究样本的基因组数据。登陆cBioPortal官网(http:∥www.cbioportal.org/)，在数据库检索界面输入具体筛选条件如下。(1) Select Studies条目:选择Lung Cancer；(2) Lung Adenocarcinoma:选择Broad数据库(Cell 2012，183例样本)、MSKCC数据库(Science 2015，35例样本)、TCGA(PanCancer Atlas，566例样本)、TSP(Nature，163例样本)、MSKCC数据库(Cancer Discov 2017，915例样本)，共5个数据集被纳入；(3) Select Molecular Profiles条目:勾选Mutation和Copy Number Alterations选项；(4) Enter Gene:输入TPX2，提交检索。

1.5 Kaplan-Meier Plotter数据库

Kaplan-Meier Plotter在线生存分析数据库[12](网址http:∥kmplot.com)是根据已发布的微阵列的肿瘤相关数据库使用20多类癌症相关样本评估54000 多个基因对生存的影响的数据集，其中最大的数据集包括乳腺癌(6234例)，卵巢癌(2190例)，肺癌(3452 例)和胃癌(1440例)样本。该数据库的基因芯片和RNA序列数据来源包括GEO、EGA和TCGA数据库。本研究使用该数据库分析了TPX2 mRNA表达和肺腺癌患者预后之间的关系。

1.6 OncoLnc数据库

OncoLnc网站[13](http:∥www.oncolnc.org/)是一种基于TCGA肿瘤数据库交互式分析基因(mRNA，miRNA或lncRNA)表达和总共21种常见癌症的生存相关性的在线工具，使用该网站再次验证TPX2基因mRNA表达与患者预后的相关性。

1.7 肺癌细胞株和肺腺癌组织标本

肺癌细胞系由本实验室提供。20例肺腺癌组织级配对癌旁组织样本取自本院胸外科，患者的病理信息包含年龄、性别、病理类型、TNM分期、生存状态及总生存时间(overall survival time,OS)。肿瘤组织经过了两名以上的病理学专家进行重新阅片确定。本项目涉及的患者签署了知情同意书，且项目已通过伦理委员会批准。

1.8 主要试剂

胎牛血清、DMEM购自美国Thermo Fisher Scientific公司；β-actin抗体购自美国Sigma公司；TPX2抗体购自英国Abcam公司，SDS-PAGE凝胶试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.9 Western印迹法

用PBS洗涤培养的肺癌细胞3次，加入RIPA细胞裂解液，置于冰上30min，然后转移至新的EP试管中，离心(离心半径20cm，1000r/min，10min)。取上清液并使用BCA蛋白检测试剂盒中检测总蛋白质。加入50μL按比例配制好的巯基乙醇同上样缓冲液的混合液，并100℃水浴锅中加热10min。取10μg蛋白用于SDS-PAGE电泳，然后将蛋白质转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉在室温下密封1h，加入一抗(1∶1500)，在4℃的振荡器中孵育晚上，TBST洗膜3次后，加二抗(1∶5000)，室温封闭1h，继续用TBST清洗膜3次，并使用化学发光成像分析仪分析条带。

1.10 统计学处理

2 结 果

2.1 Oncomine数据库分析TPX2 mRNA在肺腺癌和癌旁组织的差异表达

本研究检索Oncomine数据库中的数据集TPX2在肺腺癌组织及正常组织中的mRNA水平表达进行了分析。结果显示，共有8项数据集，每项研究的差异比较见图1。

图1 TPX2 mRNA在Oncomine数据库不同数据集中肺腺癌和正常组织中表达对比Fig.1 Comparison of TPX2 mRNA expression in lung adenocarcinoma and normal tissues in different data sets of Oncomine database

同时对8项数据集检索分析发现，在每一项研究中，肺腺癌组织中的TPX2的mRNA表达水平均要显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 TPX2 mRNA在Oncomine数据库中表达水平分析Fig.2 TPX2 mRNA expression level analysis in Oncomine database1～8分别代表8项不同肺腺癌的研究数据集，红色代表过表达，蓝色代表低表达

2.2 TPX2在肺腺癌中的蛋白质表达情况分析

使用HPA数据库的组织图谱分析TPX2蛋白质在肺腺癌组织中的表达情况。通过基因芯片分析，结果显示TPX2在肺腺癌细胞的细胞核中表达。通过芯片结果分析TPX2在肺腺癌组织中表达情况，见图3。

图3 TPX2蛋白在正常肺组织及肺腺癌组织表达的免疫组织化学图像Fig.3 Immunohistochemical image of TPX2 protein expression in normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue

2.3 TPX2表达与肺腺癌患者的临床特征分析

运用UALCAN数据库验证TPX2 mRNA在TCGA数据的肺腺癌组织(n=515)及正常肺组织(n=59)中的表达情况。分析显示:相较于正常肺组织，TPX2在肺腺癌组织中的表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图4A；同时TPX2 mRNA在女性中表达高于男性，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4B；但TPX2的表达水平与肿瘤分期、年龄无显著相关性，见图4C、D。

图4 TPX2 mRNA表达与肺腺癌患者临床特征关系Fig.4 Relationship between TPX2 mRNA expression and clinical features of patients with lung adenocarcinoma

2.4 TPX2高表达和肺腺癌患者的预后相关

为了分析TPX2与肺腺癌患者预后的关系，利用OncoLnc数据库对TPX2对肺腺癌患者预后的影响进行探索，发现TPX2高表达不利于肺腺癌患者预后(图5A)并利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析进行了验证。通过Kaplan-Meier Plotter分析发现TPX2与肺腺癌OS(HR=1.8)，FPS(HR=2.82)，PPS(HR=1.63)均具有相关性，且差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见图5B～D。

图5 TPX2 mRNA表达与肺腺癌预后关系Fig.5 Relationship between the expression of TPX2 mRNA and the prognosis of Lung adenocarcinomaA:OncoLnc数据库；B～D:Kaplan-Meier Plotter数据库；OS：总生存时间；PPS：进展后生存期；FPS：无进展生存期

2.5 TPX2基因在肺腺癌中的突变信息

通过检索cBioPortal肿瘤数据库网站对5个数据集中的1807个样本进行分析后，发现共有30个样本中发生改变，总体变异率为4%，其中有16个非同义突变，TPX2拷贝数扩增有13个样本，1例为混合变异(图6A)。说明TPX2基因在肺腺癌中突变频率很低。除了突变频率较低外，在肺腺癌中突变的另一个特征是突变位点分布较广泛，突变位点图如图6B所示。随后分析了TPX2基因突变和肺腺癌患者预后关系，结果发现TPX2基因突变对肺腺癌OS无显著影响(P>0.05)，见图6C，但存在TPX2突变的肺腺癌患者比无TPX2突变患者的DFS更差，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图6D。

图6 TPX2基因突变频率及和肺腺癌预后关系Fig.6 Relationship between the gene mutation frequency of TPX2 and the prognosis of Lung adenocarcinoma

2.6 TPX2在不同肺癌细胞的表达差异

使用Western印迹法法检测了TPX2蛋白在A549、H1650、H1299、Y82、L78、H460肺癌细胞系中检测表达水平，结果见图7。

图7 Western印迹法实验检测TPX2在肺癌不同细胞系中的表达水平Fig.7 Western blotting experiment to detect the expression level of TPX2 in different lung cancer cell lines

通过Image J软件对Western印迹法图像进行分析，实验结果发现在腺癌A549、H1650、H1299细胞系，鳞癌Y82、L78细胞系，大细胞癌H460细胞系中，TPX2的表达水平较高，在腺癌H1975细胞系和鳞癌H1703细胞系中TPX2的表达水平较低。相对表达量对比分析见图8。

图8 TPX2蛋白在肺癌不同细胞系中的相对表达量Fig.8 The relative expression of TPX2 protein in different lung cancer cell lines

2.7 TPX2在肺腺癌组织标本中表达情况

在配对肺腺癌组织和癌旁组织中利用Western印迹法检测TPX2的蛋白表达水平。发现在20例样本检测中，其中有15例样本中，TPX2在肺腺癌中的表达量显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图9。

图9 TPX2蛋白在肺腺癌组织的表达情况Fig.9 Expression of TPX2 protein in lung adenocarcinomaA:Western印迹法检测TPX2在肺腺癌组织和癌旁组织中的表达水平；B:TPX2蛋白表达情况；肺癌组和正常肺组比较，*P<0.05；N：癌旁组织；T：癌组织

3 讨 论

肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[14]。在我国，肺癌亦是如此，最新统计数据显示我国2015年新发肺癌78.7万人，约占全部癌症新发人数的24.7%；新增肺癌死亡63.1万，约占全部癌症死亡人数的29.3%，其中男性多于女性[5]。吸烟、二手烟暴露和空气污染是已确定的肺癌危险因素[15]。目前肺癌的治疗仍然以手术治疗为主，其次为化疗、放射治疗、免疫治疗和中医中药治疗及联合治疗。手术治疗适用于中早期的肿瘤患者，对晚期患者手术治疗效果有限，甚至会导致病情恶化。由于肺癌早起症状并不明显，很多患者因此错过最佳诊断和手术治疗时机[16]。近年来，肺癌靶向基因治疗和以PD-1或PD-L1抑制剂为主要代表的免疫治疗，在晚期肺癌治疗中，起到了重要作用，但由于有效人群较少，肿瘤容易产生耐药性，且费用高昂，治疗较难普及[17-18]。

TPX2是XKLP靶蛋白，位于细胞核内，定位于人类染色体20q11.2，受细胞周期严格调控。TPX2是最早发现于爪蟾的微管相关蛋白，与人类功能蛋白具有高度同源性，相对分子质量为100000，是XKLP2 COOH末端区域结合在微管上的媒介，参与细胞有丝分裂过程中微管形成及纺锤体功能[4]。研究发现，TPX2在许多癌症的组织及血清中高表达，如乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤等[19-22]。Zou等[23]研究发现，TPX2水平与胆管癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化相关。Chen等[24]的研究发现，microRNA-1294通过直接靶向TPX2抑制神经胶质瘤增殖并增强其对替莫唑胺的化学敏感性。Ma等[25]研究发现，卵巢癌2种细胞株中TPX2与PLK1存在共表达情况，敲低TPX2可抑制PLK1表达，并导致细胞增殖及迁移能力减弱。Yao等[22]通过RT-qPCR和Western印迹法检测TPX2基因在黑素瘤细胞系中的表达，结果显示其显著增高。TPX2可以促进黑色素瘤细胞的增殖，并在裸鼠荷瘤实验中得到了证实。Tomii等[5]对胃癌患者使用免疫组织化学染色和荧光实时定量反转录PCR分析了胃癌肿瘤和邻近的正常组织中的RNA(mRNA)和蛋白表达情况。结果胃癌组织中TPX2的mRNA水平显著高于匹配的邻近正常组织，且TPX2过表达与年龄、组织学类型、肿瘤深度、淋巴结转移、分期和远处转移或复发呈正相关。Glaser等[26]发现，TPX2在子宫内膜癌中高表达，与患者的淋巴结转移，预后和复发密切相关。Ma等[24]研究发现，卵巢癌2种细胞株中TPX2与PLK1存在共表达情况，敲低TPX2可抑制PLK1表达，并导致细胞增殖及迁移能力减弱，TPX2可通过调节OC细胞中的PLK1/Cdc2/CyclinB信号转导通路促进细胞增殖，还可以通过调节OC细胞中的PLK1/β-catenin/MMPs信号转导来促进细胞迁移。Feng等[20]证明在过表达miR-216b可以通过激活p53信号通路并降低TPX2基因表达，能够抑制cSCC细胞的增殖、入侵和迁移，并促进细胞凋亡。

研究表明，多基因的异常表达在肺癌的发生发展中发挥了重要作用，如p53基因，PTEN基因，Rb基因和myc基因家族[27-30]。因此，找到合适的靶目标来控制肿瘤细胞的增殖、迁移对于肺癌的预防和治疗极为重要。本课题组通过对多种肿瘤相关数据库分析，本研究基于生物学方法检索了Oncomine、HPA、cBioportal以及TCGA等数据库，综合分析了TPX2基因和肺腺癌的关系。本研究首先检索Oncomine数据库分析肺腺癌中TPX2与肺腺癌的关系，结果发现TPX2在人肺腺癌不同数据集中的表达均显著高于正常肺组织，差异均具有统计学意义。采用Kaplan-Meier Plotter分析TCGA数据库中TPX2表达与患者生存期的关系，结果发现，高表达TPX2肺腺癌患者的生存期显著低于TPX2低表达肺腺癌患者，高表达患者预后更差；差异具有统计学意义。随后通过检索c Bioportal生物信息基因数据库，分析TPX2的突变频率、突变位点，发现TPX2在2项数据集存在突变，突变频率分别为4.06%(TCGA PanCan)和3.83%(Broad)，同时研究显示TPX2共有17个位点发生突变，提示TPX2与肺腺癌发生、发展密切相关。TPX2蛋白在肺腺癌患者临床组织里高表达，并且TPX2蛋白的表达量可用来监测肺腺癌复发和预后的标志，TPX2基因可能作为未来肺腺癌患者基因治疗的潜在靶点。