加味益气通玄方对大鼠脑缺血再灌注损伤的抑制作用

彭 艳，白 雪，冯文战，刘 祎，郭 佳，高 立

（1.西南医科大学附属中医医院全科医学科，四川泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院心脑病科，四川泸州 646000）

缺血性卒中是由各种原因导致局部脑组织血液供应障碍，造成神经元损伤、神经功能缺损。缓解由脑缺血引起神经系统损伤的主要方法是迅速恢复缺血区域的血流［1］，但血液再灌注会增加兴奋性氨基酸、氧自由基、细胞内Ca2+产生，均可对脑组织造成额外的损伤，即脑缺血再灌注损伤，其发生发展涉及多个信号通路的变化。其中，磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydrxy kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）-内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信号通路广泛参与调节细胞活化，炎症反应、细胞凋亡，在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用［2-3］。

研究表明，中药及其单体可通过多种途径作用于多个靶点，从而防治脑缺血再灌注损伤［4］。本实验基于古方补阳还五汤，重用黄芪及具有辛味、开通玄府的药物（如水蛭、全蝎）组成加味益气通玄方，并基于PI3K／Akt-eNOS 信号通路探讨该方对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，以期为临床用药提供依据。

1 材料

1.1 动物 72 只SD 雄性大鼠，体质量200～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（川）2015-030，动物使用许可证号SYXK（川）2014-189。实验通过四川大学华西医院伦理委员会批准，批号2019284A，其间尽量减少动物痛苦。

1.2 仪器 RM2016 切片机购自德国徕卡公司；BMJ-III 型包埋机、TSJ-II 全自动封闭式组织脱水机、PHY-III 型病理组织漂烘仪均购自常州中威电子仪器厂；AE31 倒置显微镜购自厦门麦克奥迪实业有限公司；JY200C 电泳仪、JY-SCZ4+垂直电泳槽均购自北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 试剂与药物 加味益气通玄方的成人单日用量为155 g 生药，由80 g 黄芪（批号19080063）、12 g 当归（批号19110059）、12 g 川芎（批号19100192）、12 g 赤芍、10 g 地龙（批号19070217）、10 g 桃仁（批号18110108）、10 g 红花（批号19090095）、6 g 水蛭（批号18050159）、3 g 全蝎（批号17050133）组成，上述药材购自四川新绿色药业科技发展有限公司，西南医科大学附属中医院制剂室制备中药汤剂浓缩液。氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）购自美国Sigma-Aldrich 公司（货号T8877，批号BCBX0337）；原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）凋亡检测试剂盒购自瑞士 Roche 公司（货号 11772465001，批号37412800）；裂解液购自上海雅酶生物科技有限公司（货号PC101，批号012B1050）；BCA 蛋白定量试剂盒（货号23227，批号TG268825）、ECL 显影试剂盒（货号32109，批号TF269 477 A）购自美国 Thermo 公司；抗 Akt（ab8805 ）、p-Akt（ab38449 ）、eNOS（ab76198 ）、p-eNOS（ab184154）、Bcl-2（ab32124）、Bax（ab32503）、cleaved-Caspase3（ab32042）、β-actin（ab5694）的一抗，以及辣根过氧化物酶标记的二抗（ab205718）购自英国Abcam 公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 72 只大鼠经1 周适应性饲养后，随机分为假手术组，模型组，阿司匹林组及加味益气通玄方高、中、低剂量组，每组12 只。采用改良线栓法制备脑缺血再灌注模型［5］，方法为术前禁食12 h、禁水4 h，4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿颈部正中线纵向切口，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA），分别结扎CCA 近心端、ECA 和ICA 近分叉出打活结，在CCA 近分叉处剪一倒“V”型切口，插入线栓，于插入线栓处用备用线结扎（以不出血为度），松开ICA 处活结，缓慢推送线栓和栓线，线栓进入ICA 后调整线栓头端向内向上，有阻力时停止推进，此时线栓头端正好处于大脑中动脉（MCA）起始部，造成阻断，缺血2 h后轻柔拔出线栓；假手术组仅进行颈部血管分离，不插入线栓，造模完成2 h 后大鼠出现对侧偏瘫，可认为造模成功。造模24 h 后，阿司匹林组以60 mg／kg 剂量灌胃给药，每天1 d，连续14 d；加味益气通玄方成人单日用量为155 g，而大鼠和人用药剂量的折算系数为6.25，假设人体质量为70 kg，故大鼠正常剂量为13.84 g／kg，作为中剂量组，高、低剂量组分别为中剂量组的2、0.5 倍，即27.68、6.92 g／kg，分别灌胃给药，每天1 次，连续14 d；假手术组、模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，每天1 次，连续14 d。

2.2 神经缺损评分检测 于给药后第3、7、14 天，除假手术组外各组随机选取8 只大鼠，根据Chen 等［6］报道的修正版神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）进行神经功能评价，主要内容包括运动实验（提尾实验0～3 分、行走实验0～3 分）、感觉实验（放置实验1 分、本体感觉实验1 分、平衡实验0～6分）、反射丧失和不正常运动（耳廓反射1 分、角膜反射1 分、惊恐反射1 分）及癫痫、肌阵挛、肌张力障碍（各1 分），总分18 分，分数越高，神经功能缺损越严重。

2.3 脑梗死体积比例检测 第7 天，各组随机取3 只大鼠麻醉取脑，额叶切片2 mm，2%TTC 染色15 min，缺血性梗塞区域被染成白色，非缺血性梗塞区域被染成红色，拍摄图像，通过Image J 软件计算脑梗死面积、脑组织总面积（脑梗死面积＝对侧半球面积-梗死侧半球正常组织面积），两者乘以切片厚度即为脑梗死体积、全脑体积，脑梗死体积比例＝（脑梗死体积／全脑体积）×100%。

2.4 脑组织病理学观察和凋亡测定 将大鼠脑组织制成石蜡组织切片（厚度4 μm），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜下观察病理变化。再根据TUNEL 试剂盒说明书进行脑组织凋亡检测，根据阳性细胞数量计算细胞凋亡率。

2.5 蛋白免疫印迹（Western blot）实验 收集大鼠梗塞区域的皮质组织，裂解液充分裂解组织，提取总蛋白，BCA 蛋白测定试剂盒测定浓度，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳蛋白电泳（SDS-PAGE），转移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5% 脱脂牛奶封闭1 h，并与Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3 蛋白的一抗在4 ℃下孵育过夜，将膜与耦联有辣根过氧化物酶的二抗孵育，ECL 使条带可视化。以β-actin 为内参，对结果进行均一化处理。

2.6 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，数据以（）表示，组间两两比较采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用最小显著性差异法（LSD）。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠神经功能评分 第3 天，与模型组比较，阿司匹林组、加味益气通玄方高剂量组神经功能评分均降低（P＜0.01），加味益气通玄方中剂量组、低剂量组均高于加味益气通玄方高剂量组（P＜0.01）。第7 天，各给药组神经功能评分均低于模型组（P＜0.01），加味益气通玄方低剂量组高于加味益气通玄方中剂量组、高剂量组（P＜0.01）。第14 天，各给药组神经功能评分均低于模型组（P＜0.01），加味益气通玄方低剂量组高于加味益气通玄方高剂量组（P＜0.01）。各组大鼠神经功能评分均随时间延长均呈下降趋势。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

表1 各组大鼠神经功能评分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

注：与模型组比较，∗∗P＜0. 01；与加味益气通玄方高剂量组比较，＄＄P＜0. 01；与加味益气通玄方中剂量组比较，＆＆P＜0.01。

3.2 大鼠脑组织相对梗死体积 正常大鼠脑组织呈红色，TTC 染色后变为白色。与模型组比较，阿司匹林组、加味益气通玄方高剂量组、加味益气通玄方中剂量组大鼠相对梗死体积降低（P＜0.05，P＜0.01）；与加味益气通玄方高剂量组比较，加味益气通玄方中剂量组、低剂量组大鼠相对梗死体积升高（P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠脑组织TTC 染色及相对梗死体积Fig.1 TTC staining and relative infarct volumes of brain tissue in rats in various groups

3.3 大鼠脑组织病理损伤 假手术组大鼠大脑皮质神经元细胞胞核形态和数量正常，核大而圆，核仁清晰，胞质染色均匀，部分胞质内尼氏小体清晰，未见明显坏死；模型组大鼠正常细胞数量减少，神经元结构不明显，神经纤维水肿变性，排列散乱，染色明显变浅，细胞体积减小，周围间隙增宽，细胞核固缩或溶解消失；加味益气通玄方低剂量组、中剂量组大鼠可见部分神经元变性或坏死；加味益气通玄方高剂量组、阿司匹林组大鼠偶见神经元变性或坏死；各给药组大鼠细胞与模型组比较，均排列规则，结构清晰。见图2。

图2 各组大鼠脑组织病理损伤Fig.2 Pathological injury of brain tissue in rats in various groups

3.4 大鼠脑组织细胞凋亡 与假手术组比较，模型组大鼠TUNEL 染色呈阳性的细胞数量上升，脑组织细胞凋亡率增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织细胞凋亡率均降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。见图3。

图3 各组大鼠脑组织细胞凋亡Fig.3 Cell apoptosis of brain tissue in rats in various groups

3.5 大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相关蛋白、凋亡相关蛋白表达 PI3K／Akt-eNOS 通路相关蛋白Akt、eNOS 各组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组p-Akt／Akt、peNOS／eNOS 比值降低（P＜0.01）；与模型组比较，加味益气通玄方高剂量组、阿司匹林组p-Akt／Akt、p-eNOS／eNOS 比值升高（P＜0.05，P＜0.01），而加味益气通玄方中剂量组、低剂量组无明显变化（P＞0.05）。见图4。

此外，与假手术组比较，模型组抗凋亡蛋白Bcl-2 表达降低（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3 表达及Bax／Bcl-2 比值升高（P＜0.01）；与模型组比较，阿司匹林组、加味益气通玄方高剂量组Bcl-2 表达升高（P＜0.01），Bax、cleaved-Caspase3 表达量及Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.01）；加味益气通玄方中剂量组Bcl-2 表达升高（P＜0.01），Bax／Bcl-2 比值下降（P＜0.01），Bax 表达量有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），cleaved-Caspase3 表达降低（P＜0.05）；加味益气通玄方低剂量组Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相关蛋白、凋亡相关蛋白表达Fig.4 Expressions of PI3K／Akt-eNOS pathwayrelated proteinsandapoptosis-related proteins in rats in various groups

4 讨论

本研究基于中医玄府理论，结合目前中医对中风病的研究现状，并依据古今医家相关论述及现代研究，总结该病以“虚、风、火、痰、瘀、毒”等为基本病机，确定玄府郁闭贯穿中风发病的整个阶段，以古方补阳还五汤为基础，用黄芪、当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙、水蛭、全蝎九味中药组成加味益气通玄方。结果显示，该方能有效缓解脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损，降低脑梗塞体积，改善皮质区域病理变化，表明它能保护脑组织免受缺血再灌注损伤。

大量研究表明，细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤有关［7-9］。抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax 定位于线粒体，响应凋亡刺激，Bax 从细胞质中的Bcl-2／Bax 异二聚体解离后Bax 易位到线粒体，刺激细胞色素C 释放，并进一步激活了半胱天冬酶级联反应，使Caspase3 裂解成活化的cleaved-Caspase3，最终导致细胞凋亡［10-11］，并且Bcl-2 与Bax 之间的动态平衡在脑缺血时的细胞命运中起着关键作用［12］。已有研究表明，脑缺血再灌注损伤可通过降低Bcl-2 表达、提高Bax 表达来加速生理性细胞凋亡［13-14］，本实验也得到相似结果，表明加味益气通玄方可以通过提高Bcl-2 表达，降低Bax、cleaved-Caspase3 表达及Bax／Bcl-2 比值来保护脑组织。

eNOS 可通过抑制促凋亡蛋白来发挥促增殖作用［15-18］，它产生的NO 对脑缺血再灌注损伤起到保护作用，而作为其活性和缺血性损伤结果的关键调节剂，磷酸化eNOS 常用于评估脑血管功能［19］，并且还能调控体内脑血流量，改善慢性脑灌注不足引起的认知障碍［20］。eNOS 活性受多种机制调控，其中经典信号通路PI3K／Akt 是调控其活化的关键途径之一，故阻断PI3K／Akt 可抑制其活性［21］。前期报道，与假手术大鼠比较，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中PI3K／Akt-eNOS 活性降低［8，22］；本研究也发现，缺血再灌注损伤后大鼠脑组织中p-Akt、p-eNOS 表达低于假手术组，而加味益气通玄方干预后被重新激活。

综上所述，加味益气通玄方可缓解脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损，降低脑梗塞体积，改善皮质区域病理变化，减失皮质区细胞凋亡，其机制可能是降低了Bax／Bcl-2 比值，激活PI3K／AkteNOS 通路。