3 种提取方法对二黄汤中5 种成分在大鼠体内药动学的影响

王京龙，于定荣，张 超，王英姿，孙秀梅，张兆旺

（1.枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东枣庄 277160；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；3.山东中医药大学药学院，山东济南 250355；4.北京中医药大学药学院，北京 100029）

二黄汤源于《医宗金鉴》，由黄芩、黄连、甘草组成，是清热解毒的常用方剂［1］。研究表明，方中黄酮、生物碱、三萜是药效物质基础，药理作用集中在抗病原微生物［2-3］、解热［4-5］、抗炎［6-7］等方面。

半仿生-酶法在半仿生法［8］的基础上引入生物酶提取技术，是后者进一步“仿生化”设计，首先选择适宜的生物复合酶对中药进行预处理，再按半仿生法于第一煎、第三煎溶剂中加入适宜消化酶，在优选温度下进行提取，所得活性混合物更有利于胃肠吸收。该方法被广泛应用于中药及其复方提取中［9-11］，与传统水提法和醇提法相比，它在活性成分提取效率［12-13］、药效作用［14-15］方面具有一定优势。

课题组前期分别优化了二黄汤3 种提取工艺［16-17］，但给药后提取物体内吸收情况尚不明确。因此，本实验采用HPLC-MS／MS 法［18］测定3 种提取方法下二黄汤中甘草苷、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、甘草次酸在大鼠体内的血药浓度，比较不同提取液药动学差异，以期为相关现代制剂的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 系列高效液相色谱仪，配置Agilent 6410 三重串联四极杆LC／MS 系统（Triple Quad LCMS System）、电喷雾电离源（ESI）（美国Agilent 公司）；EVA50A 氮吹仪（北京普利泰科仪器有限公司）；CEN-TRIFUGE-5424R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；VX-200 涡旋混合仪（美国Labnet 公司）；XS105DZ 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DH-系列中空纤维超滤膜（上海德宏生物医学科学科技发展有限公司）。

1.2 试剂

1.2.1 半仿生-酶提取液、半仿生提取液制备 按照课题组前期报道的方法制备［16］，浓缩，即得（每1 mL 相当于处方药材1 g）。

1.2.2 醇提液制备 采用比例分割法［19］。优选最佳醇提体积分数为55%，在药材粒度、提取次数、提取时间、过滤、浓缩等条件与半仿生法相同的条件下制备，浓缩，即得（每1 mL 相当于处方药材1 g）。

1.3 药物 甲醇、乙腈为色谱纯（Merck 公司）；乙酸铵、甲酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水。

1.4 动物 雄性SD 大鼠，体质量（200±20）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（鲁）20140007。

2 方法

2.1 HPLC-MS／MS 条件

2.1.1 色谱 Inertsil ODS-SP 色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 甲酸（含10 mmol／L 乙酸铵）（B），梯度洗脱（0～6 min，20%～100% A；6～13.5 min，100% A；13.5～13.7 min，100%～20% A；13.7～20 min，20%A）；体积流量0.6 mL／min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.1.2 质谱 离子源温度350 ℃；雾化气体积流量10 L／min；喷雾器气压40 psi（1 psi ＝0.133 kPa）；离子源喷射电压±4 500 V；电喷雾电离源，多反应监测模式（MRM），正负离子切换同时测定；正离子模式下，黄芩苷m／z447.2～271.1（碰撞能量25 V），黄芩素m／z271.1～123.1（碰撞能量25 V），巴马汀m／z352.3～336.2（碰撞能量22 V），小檗碱m／z336.3～320.2（碰撞能量21 V），甘草次酸m／z471.4～189.3（碰撞能量35 V），荷叶碱（内标）m／z295.8～265.9（碰撞能量20 V）；负离子模式下，甘草苷m／z417.2～135.2（碰撞能量22 V），橙皮苷（内标）m／z608.5～608.5（碰撞能量0 V），熊果酸（内标）m／z455.4～455.4（碰撞能量0 V）［18］。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取黄芩苷、黄芩素、甘草苷、小檗碱、巴马汀、甘草次酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制得各成分质量浓度分别为 0.547、0.198、0.154、0.2、0.25、0.199 mg／mL 的溶液，4 ℃下冷藏备用，实验时取适量置于10 mL 量瓶中，用“2.1.1”项下流动相稀释，即得。

2.2.2 内标溶液 精密称取橙皮苷、荷叶碱、熊果酸对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制得各成分质量浓度分别为0.147、0.17、0.174 mg／mL 的溶液，4 ℃下冷藏备用，实验时取适量置于10 mL 量瓶中，用“2.1.1”项下流动相稀释，即得。

2.3 给药与样品采集 将18 只大鼠随机分为3 组，每组6 只，灌胃给予“1.2”项下3 种提取液（分子量≤1 000 Da），剂量均为15.0 g／kg，给药前12 h 禁食不禁水。于给药前及给药后0.083、0.167、0.333、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h 大鼠眼眶后静脉丛取血各0.5 mL，肝素抗凝，4 000 r／min 离心10 min，制备空白血浆、含药血浆，-20 ℃下冷藏备用。

2.4 血浆处理 准确吸取0.2 mL 含药血浆，加入0.1 mL 内标溶液、20 μL 乙酸铵溶液（冰醋酸调pH 至4），混匀后加入0.8 mL 甲醇涡旋2 min，沉淀蛋白，上清液在10 000 r／min 转速下冷冻离心10 min，取上清液，用35 ℃氮气吹干，残渣加入0.15 mL 流动相涡旋3 min，复溶物在15 000 r／min转速下冷冻离心10 min，取上清液。

3 结果

3.1 方法学考察 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液各0.1 mL，置于1.5 mL 离心管中，加入0.2 mL 空白血浆，按“2.4”项下方法处理。以血浆中各成分质量浓度为横坐标（X），待测物、内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，以S／N ＝10 计算定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

再参考课题组前期报道的方法［18］，进行精密度、准确度、提取回收率、基质效应、稳定性试验，发现所得结果均符合生物样品测定要求。

3.2 血药浓度测定 精密吸取“2.3”项下含药血浆，按“2.4”项下方法处理，在“2.1”项条件下进样测定，并绘制血药浓度-时间曲线，结果见图1。

图1 各成分血药浓度-时间曲线Fig.1 Plasma concentration-time curves for various constituents

3.3 主要药动学参数比较 通过PKSolver 药动学药效学数据处理软件，采用非房室模型测定大鼠给药后不同时间点血药浓度，计算各成分主要药动学参数，以SPSS 17.0 软件进行t检验，结果见表2。

3.3.1 甘草苷 半仿生-酶提取液、半仿生提取液中tmax短于醇提液中；半仿生提取液中Cmax大于半仿生-酶提取液中（P＜0.01），AUC0～t、CL／F高于其他2 种提取液中（P＜0.01），其原因是虽然半仿生-酶提取液中tmax与半仿生提取液中相近，但甘草苷含量在前者中更高［16］，从而Cmax、AUC0～t也较高。

3.3.2 黄芩苷 3 种提取液中tmax均为0.083 h，而且图1B 中血药浓度-时间曲线呈双峰，提示肝肠循环在黄芩苷代谢中起到重要作用［20］；半仿生-酶提取液中Cmax高于半仿生提取液中，与醇提液中比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；半仿生-酶提取液中AUC0～t较高，但与半仿生提取液、醇提液中比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；半仿生-酶提取液中CL／F与醇提液中比较，差异有统计学意义（P＜0.01），而与半仿生提取液中比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明该成分吸收以半仿生-酶法提取时较好，半仿生法提取时次之。黄芩素在进入小肠上皮细胞后可迅速转化为黄芩苷，随后有一部分通过MRP3 蛋白转运入血，并从肠系膜静脉进入肝脏进一步代谢［21］，而另一部分被MRP2 蛋白泵送回肠道［22］。本实验发现，黄芩苷在血液中的动态变化是由其原型成分经水解、还原后被吸收，以及药液中本身存在的一定量黄芩素直接吸收，经过还原过程后共同入血产生。

表2 各成分主要药动学参数（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝6）

表2 各成分主要药动学参数（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝6）

注：与半仿生-酶法比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0. 01；与醇提法比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.3.3 巴马汀 半仿生-酶提取液中tmax低于其他2 种提取液中，而且图1C 中血药浓度-时间曲线呈双峰，提示巴马汀在吸收过程中也存在肝肠循环模式；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于醇提液中（P＜0.01），但与半仿生提取液比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 种提取液中CL／F比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。综上所述，巴马汀吸收以半仿生-酶法提取时较好，其次是半仿生法提取时。

3.3.4 小檗碱 半仿生-酶提取液中tmax短于其他2 种提取液中，而且图1D 中血药浓度-时间曲线呈双峰，表明小檗碱在吸收过程中也受到肝肠循环的影响；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于其他2 种提取液中（P＜0.01）；3 种提取液中CL／F比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。综上所述，小檗碱吸收以半仿生-酶法提取时较高，其次是半仿生法提取时。

3.3.5 甘草次酸 半仿生-酶提取液、半仿生提取液中tmax短于醇提液中，仅为8 h，而文献［23-24］报道，甘草次酸tmax一般在10～12 h 之间，推测上述情况可能是由于采样点较少而导致其差异较大；半仿生-酶提取液中Cmax、AUC0～t高于其他2 种提取液中（P＜0.01），表明甘草酸转化为甘草次酸后的吸收以半仿生-酶法提取时较高，其次是半仿生法提取时。另外，大鼠灌胃给予甘草酸后血液中几乎检测不到该成分，这是因为它在小肠中肠道菌群的作用下转化成苷元甘草次酸后再吸收入血，从而发挥治疗作用。

4 讨论

本实验发现，不同提取方法对二黄汤中5 种成分在大鼠体内吸收速度（tmax）、吸收程度（Cmax、AUC0～t）、代谢消除率（CL／F）均有不同程度的影响，其中甘草苷吸收效果以半仿生法提取液较好，其Cmax、AUC0～t最高；黄芩苷、巴马汀、小檗碱和甘草次酸吸收效果均以灌胃给药半仿生-酶提取液为佳。另外，甘草苷、小檗碱、巴马汀、甘草酸体内生物利用度的差异与其在提取液中的含量呈正相关性，表明有效成分含量是影响其药动学的关键因素。

在5.0～40 g／L 质量浓度范围内，甘草苷吸收方式均为被动转运；黄芩苷、巴马汀、小檗碱、甘草酸在低质量浓度时以被动转运为主，而在高质量浓度时受到自身抑制作用而出现饱和现象。在3 种提取方法所得提取液中，各成分吸收速率常数（Ka）、有效渗透率（Peff）、累积吸收量均有所不同，而且其肠吸收动力学与体内药动学保持一致。

本实验选择了橙皮苷、荷叶碱、熊果酸作为内标，分别测定黄酮（黄芩苷、甘草苷）、生物碱（巴马汀、小檗碱）、皂苷（甘草次酸）血药浓度，由于待测成分与内标结构类似，使得后者校正结果更精确。在优化质谱条件时发现，甲酸中加入少量醋酸铵可显著改善各成分色谱峰形，并提高甘草苷、甘草次酸离子化效率，故以乙腈-0.1% 甲酸（含10 mmol／L 乙酸铵）为流动相进行梯度洗脱，可降低检测限，提高含量测定准确度。