肉牛场环境中枯草芽孢杆菌的16S rDNA 分离鉴定

王国艳，乔国峰，范建强，党文庆，何 敏，张国权

（1.山西农业大学动物医学学院，山西 太原 030032；2.娄烦县万顺源农牧发展有限公司，山西 太原 030300）

抗生素因能够防止细菌性疾病发生、提高动物生长性能等优点，近年来广泛应用于畜牧业[1-3]。但抗生素易在动物体内残留，引起细菌等产生耐药性，因此，寻找绿色的抗生素替代品成为热点研究方向[2-4]。

枯草芽孢杆菌是一种好氧、嗜温，并且能够形成芽孢的细杆状细菌，对营养需求较低，生长速度较快[5-7]，能够在消化道中较为稳定地生长[8]，具有调节肠道菌群、抑制肠道中有害菌群生长的作用，可促进动物机体的免疫器官发育[9-10]。本试验采集牛场饲料、干草、空气、水源、粪便等样品，分离得到菌株并对其进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 样品来源

山西省某肉牛养殖场的精补料、青贮饲料、水源、干草、粪便、空气样品。

1.2 培养基及试剂

LB肉汤液体培养基、普通营养琼脂培养基、生化试剂管均（青岛生物有限公司）；琼脂糖（上海生物工程有限公司）。

PCR 引物、各型号tips（派诺森基因科技有限公司）；dNTP、TaKaRa LA TaqTM 聚合酶（TaKaRa有限公司）。

1.3 细菌的分离培养

在超净工作台上将饲料、水、干草分别放入LB肉汤试管，恒温增菌培养16 h，将增菌液划线接种于琼脂平板，37 ℃培养16 h；将粪便划线接种于琼脂平板，37 ℃恒温过夜培养；将牛舍中开盖静置3 min 的琼脂平板盖好盖子，37 ℃恒温培养过夜。观察各平板的细菌生长状态。

1.4 涂片镜检

挑取琼脂平板上有褶皱的单菌落，进行革兰氏染色、镜检。

1.5 生理生化试验

选取葡萄糖、乳糖、甘露醇、硫化氢等微量生化鉴定管，采用接种针穿刺待检菌株接种于微量生化鉴定管中，37 ℃过夜培养，观察并记录。

1.6 药敏试验

采用KB纸片法，选取阿米卡星、头孢哌酮、头孢曲松、氧氟沙星、丁胺卡那、庆大霉素等临床常用的6种药物进行体外药敏试验，37 ℃培养20 h，测定抑菌环并记录结果。

1.7 16S rDNA PCR基因序列测定（见表1、表2）

将用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取到的DNA 作为16S rDNA基因PCR扩增模板。根据GenBank数据库查询，用Primer6.0设计16S rDNA引物，由派诺森基因科技有限公司合成[11-12]。引物序列设计见表1。

表1 引物序列设计Tab.1 Primer sequence design

PCR扩增反应体系见表2。

表2 PCR扩增反应体系Tab.2 PCR amplification reaction system

反应程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃终延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 细菌培养（见图1）

由图1可知，肉汤液体浑浊；空气、水源、饲料、干草的琼脂平板均无褶皱型单菌落生长；粪便接种的普通琼脂营养平板上有乳白色、隆起、褶皱样菌落生长。

图1 琼脂平板上的菌落Fig.1 Colonies on agar plates

2.2 显微镜下的菌落形态（见图2）

由图2 可知，显微镜油镜下观察为单个排列的革兰阳性细长杆菌。

图2 显微镜下的菌落形态Fig.2 Colony morphology under microscope

2.3 生化试验结果（见表3）

参照《伯杰细菌鉴定手册》[13]、《常见细菌系统鉴定手册》[14]，由表3 可知，待检菌株的生理生化特性初步符合枯草芽孢杆菌。

表3 生化试验结果Tab.3 Biochemical test result

2.4 药敏试验结果（见表4）

表4 药敏试验结果Tab.4 Result of drug sensitivity test

由表5可知，该菌株对6种药物均表现出高度敏感，表明该菌株无耐药性。

2.5 PCR扩增结果（见图3）

由图3可知，得到大小约为1 500 bp的目的条带。

图3 PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification result

2.6 16S rDNA鉴定结果

取各个菌种纯化后的PCR 产物，使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。采用NCBI Blast 程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S 数据库中的数据进行比对。结果表明，扩增序列与NCBI 公布的NR_112686.1 参考株同源性达99.93%，该分离株为枯草芽孢杆菌。

3 讨论

近年来，为减弱因抗生素滥用造成的细菌耐药、DNA污染等危害，益生菌制剂受到广泛关注[15]。芽孢杆菌作为一类重要的生物防控菌株，已得到广泛开发应用，枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂，具有广阔的应用前景[16-17]。杜汉宇等[18]认为，从动物机体及其存活的养殖环境中分离出来的益生菌与动物保持长期的共生状态，具有相互选择关系，易于在该类动物机体内定植，因此适合作为生态制剂加入饲料中。本研究从肉牛场粪便中分离出的枯草芽孢杆菌，可考虑应用于肉牛饲料添加剂，为肉牛养殖微生态饲料添加剂的开发提供候选菌株。

4 结论

本试验采集肉牛场环境样品，符合枯草芽孢杆菌的形态鉴定，镜检为细长的杆菌；16S 序列鉴定，PCR 扩增条带为1 500 bp 左右，序列比对结果同源性达99.93%，鉴定为枯草芽孢杆菌。