成釉细胞瘤基质金属蛋白酶-2表达的初步研究

陆长玺， 郭传瑸

（1.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院口腔综合科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海 200011；2.北京大学口腔医学院口腔颌面外科，北京 100081）

在原发肿瘤逐渐侵袭的过程中，除抑制肿瘤细胞增生外，降解细胞外基质的能力对肿瘤的侵袭也十分重要。细胞外基质的降解主要靠蛋白水解酶。基质金属蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）是4类蛋白水解酶（丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶）中较重要的一类。

MMP是一组锌离子依赖性内肽酶，经典型MMP以水溶性酶原形式分泌到细胞外，需要在激活剂作用下才具有酶活性；新型MMP则不同，分泌型MMP直接以活性酶的形式分泌到细胞外，而另一种膜型的MMP则结合在胞膜上。研究表明，在多种类型的肿瘤系中，MMP的表达水平和活性水平与其侵袭性和转移成正相关[1-5]。

MMP-2也称为Ⅳ型胶原酶，其可以降解Ⅳ型胶原，Ⅳ型胶原同时也是构成基底膜的主要胶原成分。研究普遍认为，MMP-2水平可能是肿瘤恶性程度的标志之一。本研究对MMP-2在成釉细胞瘤体及骨组织中的表达进行检测，探讨其在成釉细胞瘤侵袭及骨破坏过程中的作用。

1 资料和方法

1.1 组织标本准备

石蜡标本共26块，为2005—2009年北京大学口腔医院手术所得，其中确诊为成釉细胞瘤的标本为25块，恶性成釉细胞瘤为1块。成釉细胞瘤病理类型包括单囊型（11例）、一般型（13例）及角化型（1例）。其中，一般型又可分为4个亚型：滤泡型、丛状型、棘皮瘤型、颗粒细胞型。标本均用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）充分脱钙后进行连续切片，切片厚度为5 μm，随后进行免疫组化染色。

1.2 免疫组化染色

试剂包括免疫组化通用型试剂盒,兔抗人MMP-2多克隆抗体,增强聚合物法染色剂（diaminobenzidine,DAB）。以上试剂均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

染色过程：石蜡切片，60℃烤片2 d后，常规脱蜡至水，柠檬酸溶液下微波抗原热修复15 min，3%过氧化氢去离子水孵育10 min，以消除内源性过氧化氢酶活性；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）冲洗3次，每次3 min，滴加正常山羊血清工作液（A液）置室温孵育15 min，倾去，滴加MMP-2多克隆抗体（一抗），37℃下孵育3 h；PBS冲洗3次，每次3 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG（B液）置室温孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液（C液）置室温孵育15 min；PBS冲洗3次，每次3 min，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片剂封片。

1.3 结果判断

因细胞较少，本研究采取如下方法判断：MMP-2阳性染色定位于细胞质，在高倍镜下观察，深褐色区域>50%为强阳性,26%～50%为中等阳性，5%～25%或仅有少量斑点为弱阳性，<5%为阴性。此外，因细胞数过少或其他原因无法确定的标本判定为“不确定”。分别将已知的阳性片和PBS代替一抗（MMP-2）设为阳性和阴性对照。

1.4 结果分析

分析软组织中MMP-2的表达，包括肿瘤组织及基质组织。分析骨组织中MMP-2的表达，探讨其与骨侵袭性的关系。分析各型成釉细胞瘤中MMP-2的表达是否有差异，以及此差异是否与侵袭性相关。

1.5 统计学分析

统计MMP-2表达的总阳性率，比较各病理类型的阳性率，使用SPSS 16.0软件进行χ2检验及方差分析。

2 结果

2.1 MMP-2染色结果

在成釉细胞瘤中，绝大部分MMP-2强阳性表达存在于外周柱状细胞的胞质中，少量细胞膜呈MMP-2阳性表达，中心星网状细胞少见或未见表达。许多基质中类似成纤维细胞的组织也存在MMP-2的阳性表达。

如图1所示，在单囊型成釉细胞瘤的囊壁细胞内，MMP-2呈强阳性表达，MMP-2在囊壁基底层呈强阳性表达,纤维结缔组织中也有MMP-2的强阳性表达；肿瘤组织少部分外层柱状细胞质内可见MMP-2表达（白色箭头），少量中心星网状分化细胞可见MMP-2表达（红色箭头）。所以，单囊型MMP-2的表达主要发生在基质中。

图1 单囊型成釉细胞瘤免疫组化染色图（×200）Figure 1 Immunohistochemistry staining of unicystic ameloblastoma （×200）

如图2所示，丛状型成釉细胞瘤免疫组化染色可见肿瘤上皮岛外周柱状细胞质内有MMP-2阳性表达，基质中出现MMP-2强阳性表达；神经组织外周也有MMP-2阳性表达（白色箭头）。

图2 丛状型成釉细胞瘤免疫组化染色图（×400）Figure 2 Immunohistochemistry staining of plexiform ameloblastoma （×400）

如图3所示，角化型成釉细胞瘤免疫组化染色结果显示，肿瘤细胞中心为角化物，MMP-2呈强阳性表达，外周柱状细胞质呈MMP-2强阳性表达。

图3 角化型成釉细胞瘤免疫组化染色图，肿瘤及角化物（×400）Figure 3 Immunohistochemistry staining of keratotic ameloblastoma,tumor and keratin （×400）

恶性成釉细胞瘤免疫组化染色结果显示，肿瘤细胞排列无规律，可见核分裂象，整个肿瘤组织中的细胞质中均有MMP-2阳性表达（图4）。

2.2 统计学结果

本研究中，MMP-2表达的总阳性率为88.5%，强阳性率为65.4%，中等阳性率为15.4%，弱阳性率为7.7%，阴性率为3.8%，不确定的为7.7%。其中，一般型成釉细胞瘤MMP-2表达的总阳性率为76.9%，强阳性率为61.5%，中等阳性率为7.7%，弱阳性率为7.7%，阴性率为7.7%，不确定的为15.4%；单囊型成釉细胞瘤MMP-2表达的总阳性率为100%，强阳性率为63.6%，中等阳性率为27.3%，弱阳性率为9.1%，无阴性及不确定的病例；角化型及恶性成釉细胞瘤均呈MMP-2强阳性表达。不同病理类型成釉细胞瘤中MMP-2的表达情况见表1。

将一般型及单囊型成釉细胞瘤MMP-2阳性率进行卡方检验，结果显示两者MMP-2的表达无明显差异（P>0.05）。

图4 恶性成釉细胞瘤免疫组化染色图 （×400）Figure 4 Immunohistochemistry staining of malignant ameloblastoma （×400）

3 讨论

恶性肿瘤的发展过程中，癌细胞必须突破基底膜才能从原位癌向周围组织侵袭，进而发展成为浸润癌。基底膜是肿瘤细胞侵袭生长的主要屏障，主要成分有Ⅳ型胶原、层连蛋白（laminin,Lm）和纤维粘连蛋白（fibronectin,Fn）等，其中Ⅳ型胶原可能是最主要、最稳定的成分。MMP几乎可以降解所有细胞外基质 （extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）成分，在肿瘤细胞突破基底膜和侵袭转移过程中起重要作用[6]。

MMP在肿瘤细胞移动侵袭过程中的多重作用主要为直接降解基底膜成分。如MMP-2可水解Ⅳ型胶原，破坏基底膜的完整性；调节细胞黏附，打破原有的黏结，形成新的细胞间及细胞基质间的黏附，有利于细胞的游走；MMP作用于ECM能激活生成新的活性因子，产生一系列反应[7]。

表1 不同病理类型成釉细胞瘤中MMP-2的表达情况（例）Table 1 Expression of MMP-2 in different pathological types of ameloblastoma （case）

成釉细胞瘤虽然是良性肿瘤，但包膜不完整，具有局部侵袭性。有学者从细胞增殖活力的角度分析了成釉细胞瘤的生物学行为，通过对成釉细胞瘤和角化囊肿细胞的体外培养观察发现，两者的细胞生长特点不同，前者细胞增殖活跃，具有主动性生长的特点，细胞向周围游走的能力强；而后者细胞的膨胀性生长能力强，能使病变范围变大，并具有术后易复发的特点。Piattelli等[8]的研究表明，成釉细胞瘤的增殖细胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）细胞主要集中在肿瘤上皮岛的外周细胞上，提示外周细胞的增殖活跃，在成釉细胞瘤的发生和发展过程中起重要作用。

关于基底膜和蛋白水解酶等在成釉细胞瘤局部侵袭中作用的研究尚少。本研究利用免疫组化的方法对MMP-2在成釉细胞瘤中的表达和分布进行研究，发现在26例成釉细胞瘤中，对于基质细胞，有24例可见MMP-2强阳性染色；对于肿瘤细胞，大部分MMP-2阳性表达位于外周柱状细胞,中心星网状细胞少见或未见表达。

本研究中，MMP-2表达的总阳性率为88.5%，强阳性率为65.4%，阴性率为3.8%。Kumamoto等[9]的研究显示，MMP-2表达的总阳性率为93.2%，强阳性率为45.5%，阴性率为6.8%。Fregnani等[10]的研究显示，肿瘤细胞中MMP-2表达的阳性率为47.3%，基质细胞中为38.2%，总阳性率为85.5%。陶谦等[6]的研究显示，MMP-2表达的总阳性率为92%，强阳性率为84%，阴性率为8%。孙福星等[11]的研究显示，中等至强的阳性率为79%。以上结果显示，各研究的总阳性率差别较小，而强阳性率差别较大，可能与实验条件和判断标准有关。

角化型成釉细胞瘤的外周柱状细胞胞质中，MMP-2呈强阳性表达，其角化物中的MMP-2也呈现强阳性表达，这提示了角化型成釉细胞瘤的侵袭性可能大大强于单囊型及一般型成釉细胞瘤。

1例恶性成釉细胞瘤中，肿瘤组织不呈现“成釉器”样表现，MMP-2的阳性表达也不局限在外周细胞，在中心部分也有强阳性表达。

本研究结果提示，成釉细胞瘤的外周细胞或基质细胞中产生的MMP-2可致基底膜成分Ⅳ型胶原降解，破坏基底膜的完整性，这可能是成釉细胞瘤局部侵袭生长的机制之一。但不同病理类型间的MMP-2表达并无显著差异（P>0.05）。Fregnani等[10]将丛状型与其他病理类型的成釉细胞瘤比较，MMP-2的表达无显著差异（P>0.05）。Kumamoto等[9]比较了丛状型和滤泡型成釉细胞瘤中MMP-2的表达，未见明显差异（P>0.05）。陶谦等[6]的研究则提示，MMP-2的表达与是否为单囊型或一般型无关，但成釉细胞瘤与角化囊肿及含牙囊肿间的差异显著。

临床上，一般型成釉细胞瘤的复发率较单囊型高，主要原因可能并不在于MMP-2的表达或侵袭的深度，而是由于单囊型成釉细胞瘤无实性瘤体，边界光滑，容易刮治，而一般型成釉细胞瘤为多囊，呈囊实性混合肿块，其对骨壁的不规则侵袭造成瘤体不易被刮净，而需采用一定边界范围的切除法。