含枯草芽孢杆菌肥料对大豆叶片光合作用及土壤酶活性的影响

黄国东，宋清晖，王晓慧，王学刚，冯宇涵，孙思淼，李洪涛，张占胜，王 楠，宋福强

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心， 黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室， 黑龙江 哈尔滨 150080；3.黑龙江省庆东阳光农业生物科技股份有限公司，黑龙江 肇东 151100)

0 引 言

大豆(Glycinemax)是我国重要的经济作物，东北是大豆的主产区，其中黑龙江省种植大豆的面积最大。为了保证大豆的产量，采取的主要措施就是大量施用化肥[1]。过量施用化肥会加重土壤酸化和盐渍化，从而间接引起植物病害发生，作物减产，生产成本提高及环境污染等问题[2]。因此，开发环境友好型肥料及合理的施肥措施是保证作物产量，恢复土壤肥力，维持农业可持续发展的重要途径[3]。

利用微生物肥料修复或改良土壤生态系统，恢复土壤肥力成为降低化肥对土壤污染问题的有效措施[4]。大豆施用微生物肥料，不仅可以减少化肥用量，还可以减少土壤中养分的损失，活化土壤养分，利于养分的有效化，促进大豆对土壤养分的有效利用，提高肥料利用率。孙壮等[5]研究表明，适当减少化肥的用量，配合适量的生物菌剂可以有效提高大豆产量，降低成本。马鸣超等[6]发现，对大豆施用胶质类芽孢杆菌和慢生大豆根瘤菌的复合菌剂不但能够改善大豆品质，增加大豆产量，还能提高土壤肥力，改善土壤微生物区系。因此，施用微生物肥料是一种具有良好应用前景的施肥方式。

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)因其可以通过固氮、溶磷、解钾及产生抗生物质促进植物生长，提高植株抗病性和抗逆性等功能[7]，在农业生产中被广泛应用。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为植物根际促生菌的一种，在促进植物生长和改善土壤环境方面有良好的效果。尹施淇[8]发现，用枯草芽孢杆菌菌剂部分代替化肥能够改善土壤环境，提高辣椒对土壤养分的吸收能力。缑晶毅[9]研究认为，施用枯草芽孢杆菌菌剂明显提高了蒺藜苜蓿和白三叶草的叶绿素含量。

前人对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在高效菌株的筛选和单独施用枯草芽孢杆菌菌剂对植物和土壤的影响，而枯草芽孢杆菌与其他肥料联合施用对植物和土壤的影响鲜有报道。本研究将枯草芽孢杆菌与多种肥料联合施用，以大豆为研究对象，综合评价各种肥料组合对大豆光合作用和土壤酶活的效果，以期筛选出最优的肥料组合，为开发出适应于东北黑土区大豆生产的微生物肥及减少化肥用量提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验样地位于黑龙江省绥化市肇东市试验基地(45°10′～46°20′N，125°22′～126°22′E)，试验地属寒温带气候，年平均降水量为536 mm，全年无霜期平均在140天左右。试验地土壤类型为黑钙土，土壤pH为5.3，速效N、速效P、速效K含量分别为141.5 mg·kg-1、32.6 mg·kg-1及103.2 mg·kg-1，有机质含量为37.9 g·kg-1。

1.2 试验作物和肥料

供试作物大豆品种为黑农252，市购；表1是供试肥料详细信息，枯草芽孢杆菌与各肥料均为掺混使用。试验中所用的菌株为本实验室筛选获得，菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC11025。

表1 供试肥料信息Table 1 Information of test fertilizers

1.3 试验设计

田间种植，共设6个处理，每个处理3次重复，共计18区，各区随机分布。每个区面积667 m2，垄作，垄间距0.6 m，株距0.25 m，播种密度为4.2×105株· hm-2。其他管理措施同当地大田一致。

1.4 测定项目

大豆菌根侵染率：采用Phillip[10]的酸性品红染色方法测定。

大豆叶片光合参数：于大豆结荚期(7月29日)采用CL-3400手持光合测量系统(美国)测定各处理主茎功能叶(倒3叶)的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。

大豆叶片叶绿素含量：采用分光光度法测定叶绿素a和叶绿素b的含量以及总叶绿素含量。

土壤酶活性：根据土壤标准采样法，于大豆结荚期(7月29日)在每块样地用土钻采集耕层(0～20 cm)土壤样品1 kg。具体为每个小区随机取10个样品充分混合后带回实验室放入4 ℃冰箱保存。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定土壤中的蔗糖酶活性，结果用24 h以后1 g土壤中葡萄糖的毫克数表示(mg·g-1)；采用磷酸苯二钠比色法测量土壤中碱性磷酸酶活性，结果用2 h后1 g土中释放出的酚的毫克数表示(mg·g-1)；采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定土壤中脲酶活性，结果用24 h后1 g土中释放的NH3-N-的毫克数表示(mg·g-1)[11]。对每个处理获得的数据进行统计学分析。

1.5 数据分析

试验数据采用 Excel 2016和SPSS 25.0软件对所有数据进行差异显著性分析，采用One-Way ANOVA分析和Duncan法进行方差分析(P<0.05)，利用Excel 2016 软件作图。图表中数据为平均数±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同肥料处理对大豆侵染率和叶片光合参数的影响

各处理的菌根侵染率均在90%以上(图1)，说明各处理的大豆根系均能与丛枝菌根(AM)真菌建立良好的共生关系。菌根侵染率从大到小依次为T4>T3=T5>CK>T2>T1。各处理与CK的差异均未达到显著水平(P>0.05)。

注：不同小写字母表示处理间在0.05水平上差异显著。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at P<0.05.The same is as below.图1 不同肥料处理的大豆根系AM真菌侵染率Fig.1 Infection rates of AM fungi in soybean roots with different fertilizers

与CK相比，T2和T3处理的净光合速率显著降低了19.0%和16.3%(P<0.05，表2)，T2处理净光合速率最低为11.9 μmol·m-2·s-1，T5为净光合速率的最高为15.9 μmol·m-2·s-1。与CK相比，除T5处理的蒸腾速率显著增加29.8%外，其他处理的蒸腾速率均显著降低(P<0.05)。T5处理的气孔导度较CK显著增加32.0%，T2和T3处理分别显著降低47.6%和39.5%(P<0.05)。除T2处理外，其余各处理的胞间CO2浓度与CK差异不显著(P<0.05)。

表2 不同肥料处理大豆叶片光合参数Table 2 Photosynthetic parameters of soybean leaves with different fertilizers

各处理的叶绿素a含量，T2、T3与CK无显著差异(P>0.05)(图2)。T1处理的叶绿素a含量最高，比CK高17.3%，而T4、T5处理叶绿素a的含量较CK分别降低21.3%和24.0%，其中T5为叶绿素a含量最低。T4和T5处理的叶绿素b和总叶绿素含量显著低于CK(P<0.05)，其中，叶绿素b分别降低了32%和30.5%，总叶绿素分别降低了25.1%和27.0%。

图2 不同肥料处理大豆叶片叶绿素含量Fig.2 Chlorophyll contents of soybean leaves with different fertilizers

2.2 不同肥料处理对土壤酶活性的影响

各处理的土壤脲酶活性均显著高于CK(P<0.05，图3)，T1、T2、T3、T4、T5处理分别较CK增加了8%、12.5%、6.8%、8%和17.7%，但T1、T3和T4这3个处理之间无显著差异。

土壤蔗糖酶从高到低依次为T1>T3>CK>T5>T4>T2，其中T1、T2和T3与CK有显著差异(P<0.05，图3)。T1处理土壤蔗糖酶活性最高，为9.29mg·g-1，较CK高18.9%；T2处理土壤蔗糖酶活性最低，为5.03 mg·g-1，比CK降低了28.7%。

各处理中，T1、T4处理的碱性磷酸酶活性较CK显著增加了2.3%和7.0%(P<0.05，图3)，T2和T5处理的碱性磷酸酶活性虽然有所提升，但不显著(P>0.05)。T3处理的碱性磷酸酶活性最低仅为8.55 mg·g-1。

图3 不同肥料处理对大豆土壤酶活性的影响Fig.3 Different fertilizers effects on soil enzyme activities of soybean

3 讨论

植物生长和生物量生产的主要驱动力是光合作用，光合作用为植物提供生长发育所需的能量[12-13]。本研究结果显示枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥(T1)、枯草芽孢菌秸秆腐熟有机肥(T4)和枯草芽孢杆菌鸡粪腐熟有机肥(T5)处理的净光合速率较CK提高了5.0%、0.7%和8.0%(表2)，说明含有枯草芽孢杆菌的生物有机肥可提高大豆叶片的净光合速率。施用枯草芽孢杆菌与氨基酸颗粒的微生物复合肥能够提高净光合速率，可能有两种原因：一方面氨基酸可以被作物直接吸收利用，植物通过吸收含有碳、氮等元素的小分子态氨基酸，为植物提供氮素养分[14]，同时参与植物体内的能量代谢和有机体蛋白物质的合成[15]，加速了植物体内生理生化反应的进程，从而对植物生长发育起到促进作用；另一方面氨基酸可以作为枯草芽孢杆菌的营养物质，保证菌株在土壤中扩繁使其能够充分发挥固氮作用，进而提高土壤中可利用养分的含量，促进植株对养分的吸收利用[16]。此外，净光合速率与气孔导度呈正相关关系，也说明枯草芽孢杆菌与氨基酸颗粒的联合施用促进了大豆叶片气孔的开放，使较多的CO2能够进入到叶肉细胞中进行同化，提高了叶片的净光合速率，这与张亚等[17]的研究结果相似。施用枯草芽孢杆菌秸秆腐熟肥后提高了大豆的净光合速率，可能是由于腐熟后的秸秆作为外源碳的加入导致土壤碳氮比增加，而微生物为了适应碳氮比的变化，加速了对土壤有机质的矿化，使土壤中大量固定的氮被释放出来，从而提高了土壤的供氮能力[18]，菌株因获得了充足的养分，使得其充分发挥固氮、溶磷和解钾的作用，保证了植物的生长发育。唐志敏等[19]的试验结果表明，秸秆还田可以促进植物叶片气孔的开放，提高叶片的光合速率，本研究的结果与之基本一致。枯草芽孢杆菌鸡粪腐熟有机肥提高净光合速率的原因可能是枯草芽孢杆菌和鸡粪的联合作用，改善土壤的理化性质，增强土壤的微生物活性，增加了有机质含量，促进了植株对养分的吸收，间接影响作物的光合生理代谢，这与孙运杰等[20]在蓝莓上的研究结果一致。

决定植物光合作用强弱的因素之一是叶绿素的含量[21]。不同肥料会改变作物的叶绿素含量，从而影响光合作用。本研究发现，各处理中仅枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥(T1)处理的叶绿素含量高于CK，说明影响叶绿素含量的主要因素是与枯草芽孢杆菌联合施用的其他肥料本身。

土壤酶活是土壤质量及其健康的重要指标，因为它们对土壤的自然变化或人为变化做出响应[22]。对土壤酶活性的分析是确定作物生长和生产力最佳条件的关键因素之一。土壤脲酶活性代表将有机态土壤氮转化为有效态的能力[23]。本研究中各处理的土壤脲酶活性均高于CK，说明枯草芽孢杆菌与其他肥料的组合均可提高土壤脲酶活，这与前人对土壤脲酶的研究结果基本一致[23-24]。其中枯草芽孢杆菌鸡粪腐熟有机肥(T5)处理的脲酶活性最高，这可能是由于鸡粪提供了更多的酶促反应的底物，从而促进了土壤微生物的生长，而土壤脲酶是土壤微生物生长代谢的产物。

蔗糖酶又叫转化酶，它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要的作用，蔗糖酶活性与土壤有机质、氮、磷含量及微生物数量有关[22]。本研究发现，枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥对蔗糖酶活性的提升效果最好，提高了18.9%，说明施用枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥可提高土壤蔗糖酶活性。已有研究表明，枯草芽孢杆菌能够提高土壤微生物活性和多样性，增加土壤中细菌、放线菌和真菌的丰富度[25-26]，促进胞外酶的分泌，此外可能是氨基酸肥的施用作为外源有机物质输入土壤后，改善了土壤的碳氮比，提高了微生物的活性，促进了蔗糖酶的分泌，这与贾娟等[27]在松花菜上的研究结果基本一致。

碱性磷酸酶能促进土壤有机磷化合物水解，生成能为植物利用的无机态磷[28]。本发现枯草芽孢菌秸秆腐熟有机肥(T4)处理的碱性磷酸酶活性最高，说明施用枯草芽孢杆菌秸秆腐熟肥够提升土壤碱性磷酸活性。原因可能是秸秆中含有丰富的碳源，秸秆腐熟后能将其中的养分释放出来，促进土壤微生物繁殖，提高碱性磷酸酶活性，其次研究发现秸秆还田能够降低土壤对磷素的吸附[29]，增加土壤中速效磷的释放[30]，进而提高了碱性磷酸酶活性。

4 结 论

枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥(T1)、枯草芽孢杆菌秸秆腐熟有机肥(T4)和枯草芽孢杆菌鸡粪腐熟有机肥(T5)提高了大豆叶片光合参数、净光合速率和土壤酶活性，具有提高土壤肥力，促进植物生长，改善土壤环境的功能，有作为化肥的优良替代品应用的潜力，达到化肥减施、改善土壤环境、提高土壤肥力的目的，不建议枯草芽孢杆菌与化肥混施。