基于上转换分子印迹聚合物荧光传感检测食品中的章鱼胺

孙世明，白晓云，史爱莹，胡雪莲，赵 甜，生 威，方国臻

（天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室 天津300457）

章鱼胺（Octopamine），1-（4-羟基苯基）-2-氨基乙醇，作为一种神经递质[1]，对生物体的感觉行为、运动行为和记忆等有不同程度的影响[2-3]。对免疫系统也有一定的影响[4]。目前检测章鱼胺的方法包括电化学生物传感器法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法等[5]。荧光传感器以简单、快速、低成本和高灵敏度的优势得到研究者的关注。上转换荧光纳米粒子（UCNPs）[6]，具有荧光强度稳定，生物兼容性好，穿透性强，无背景辐射干扰等优点[7-8]。然而，上转换纳米材料缺乏有效的选择性，样品基质的复杂性限制了其在分析领域中的应用，因此在建立检测方法时对上转换纳米粒子进行靶向修饰是非常必要的。

分子印迹聚合物[9-11]（molecularly imprinted polymers，MIPs）是一种采用仿生抗原-抗体技术合成的具有高选择性、特异性的聚合物，对模板分子具有特异性吸附。表面分子印迹溶胶-凝胶技术是一种通过溶胶-凝胶法在支撑材料表面合成分子印迹聚合物的技术[12-14]。该技术合成的分子聚合物具有选择性高，吸附速率快和稳定好等特点。本研究结合上转换纳米粒子的良好荧光性能和分子印迹聚合物的高选择性，制备对章鱼胺具有特异性吸附的荧光分子印迹聚合物，建立一种章鱼胺的荧光传感检测方法，并用于食品中章鱼胺的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂与材料 章鱼胺（OA）、组胺、色胺、酪胺标准品（99.9%）；五水硝酸铒（Er（NO3）3·5H2O）、五水硝酸镱【Yb（NO3）3·5H2O）】、六水硝酸钇【Y（NO3）3·6H2O】标准品（99.9%），Sigma-ALdrich公司；APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）、TEOS（正硅酸四乙酯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其它试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备 荧光分光光度仪（F-2500型），日本HITACHI 公司；移液器（Eppendorf 100-1000 μL 型），德国Eppendorf 公司；磁力搅拌器（ZNCL-TS 型）、水浴磁力搅拌锅（DF-101S 型），巩义市予华仪器有限责任公司；超纯水系统（QSPTOC 型），美国MiLLipore 公司；台式氮吹仪（MTN-2800D 型），AUTO SCIENCE 公司；电热真空干燥箱（ZK-35B 型），天津三水科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 上转换荧光纳米粒子的制备 采用水热法[15-17]合成上转换荧光纳米粒子，将8 mL 乙醇，8 mL 油酸，700 mg 氢氧化钠粉加入150 mL 圆底玻璃烧瓶中，剧烈搅拌至液体变白。逐滴加入5 mL超纯水，搅拌至溶液变澄清。滴加0.101 g/mL 氟化钠水溶液3 mL，0.5 moL/L 硝酸钇1.56 mL，0.5 moL/L 硝酸镱400 μL，0.5 moL/L 硝酸铒40 μL，搅拌30 min，将反应溶液转移至反应釜中，230 ℃加热12 h。将反应得到白色固体沉淀离心分离，用无水乙醇洗涤3 次，60 ℃真空干燥。

1.2.2 上转换荧光纳米粒子表面包覆二氧化硅（UCNPs@SiO2）的制备 称取50 mg UCNPs 分散在80%乙醇溶液中，加入催化剂28%氨水2 mL，逐滴滴加TEOS，搅拌8 h。滴加APTES 200 μL，持续搅拌1 h。以转速10 000 r/min 离心10 min，离心产物用去离子水和乙醇交替洗涤3 次，60 ℃真空干燥12 h[18]。

1.2.3 上转换荧光分子印迹材料（UCNPs@SiO2@MIP）的制备 将1 mmoL 章鱼胺超声溶解到12 mL 乙醇中，常温磁力搅拌下逐滴滴加4 mmoL APTES，搅拌15 min，加入50 mg UCNPs@SiO2，搅拌15 min，再逐滴加入6 mmoL TEOS，加入100 μL 氨水催化，搅拌15 min，通入氮气15～20 min，密封搅拌10 h。离心产物用乙醇和水交替超声辅助洗脱数次，直至模板全部洗脱。真空干燥24 h，避光保存。

1.2.4 样品前处理 称取5.00 g 乳酪，将其搅拌均匀，加入10 mL 甲醇，涡旋振荡2 min，超声提取20 min，于4 ℃、8 500 r/min 离心10 min，将上清液过滤，剩余的残渣用10 mL 甲醇提取1 次，合并两次所得上清液，在40 ℃旋转蒸发至近干，然后用5 mL 甲醇复溶。

量取5 mL 黄酒，加入20 mL 正己烷去脂肪，用适量活性炭脱色，过滤，旋转蒸发近干，用5 mL甲醇复溶。

2 结果与讨论

2.1 优化的合成反应条件

2.1.1 分子印迹聚合物合成溶剂种类 选用乙醇、乙腈、甲醇3 种溶剂为反应溶剂，对比3 种溶剂得到的印迹聚合物和非印迹聚合物的印迹因子（IF）。如表1所示，当乙醇为反应溶剂时，合成的分子印迹聚合物吸附效果最好，印迹因子IF 为2.38。本研究选择乙醇作最佳反应溶剂。

2.1.2 分子印迹聚合物反应时间 聚合反应时间的长短会影响印迹层的厚度，从而影响聚合物对目标物的吸附效果和选择性。如果反应时间过短，聚合物就不能形成较好的网状结构和印迹位点，从而影响聚合物对目标物的吸附。如果反应时间过长，会造成印迹层过厚，使上转换材料荧光下降，进而降低聚合物的灵敏性。由表2 可知，在反应时间10 h 时，合成的分子印迹聚合物吸附效果最好，印迹因子IF 最大值为1.67。最终选择最佳反应时间为10 h。

表1 反应溶剂种类的优化Table 1 Optimization of reaction solvent types

表2 印迹聚合物反应时间的优化Table 2 Optimization of reaction time of imprinted polymer

2.1.3 UCNPs@SiO2添加量 UCNPs@SiO2为传感器的载体，其用量对传感器灵敏性有较大影响。UCNPs@SiO2添加量过多会使部分的聚合物无法接枝到UCNPs@SiO2的表面形成良好的网状结构，从而导致分子印迹聚合物的吸附能力和选择性下降；添加量过少，则降低材料的灵敏性。本研究保持反应体系中其它量不变，而改变UCNPs@SiO2的添加量。由表3 可知，随着UCNPs@SiO2量的增加，IF 呈现先增强后减弱的趋势，当UCNPs@SiO2用量为50 mg 时，IF 最大值为2.11，吸附效果最佳。

2.1.4 模板分子与功能单体和交联剂配比 模板分子、功能单体和交联剂的配比直接影响聚合物的吸附效果，由表4 可知，当三者比例为1∶4∶4 时，印迹聚合物不能形成较好的网状结构而影响聚合物对目标物分子的吸附；当三者比例为1∶4∶10 时，造成印迹聚合物的印迹层过厚，从而降低上转换材料的荧光强度；当三者比例为1∶4∶6 时，印迹聚合物吸附效果最好，IF 为2.42。

表3 UCNPs@SiO2 添加量的优化Table 3 Optimization of UCNPs@SiO2 addition

2.2 透射电镜表征

由图1 可知，UCNPs（A）为表面光滑的棒状结构，具有优良的单分散性，平均长度约2 μm。UCNPs@SiO2@MIP（B）和UCNPs@ SiO2@NIP（C）并无明显差异，其表面均包覆一层印迹层，聚合物大小均一，形态规则，说明印迹层合成。

表4 不同配比功能单体和交联剂的优化Table 4 Optimization of conditions for functional monomers and cross linker with different ratios

图1 合成材料的透射电镜图Fig.1 TEM image of the synthetic materials

2.3 吸附性能评价

2.3.1 动态吸附试验 用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 对目标物进行吸附并绘制动态吸附曲线，见图2。随着吸附时间的增加，章鱼胺印迹聚合物与非印迹聚合物对章鱼胺吸附量逐渐增大，当吸附时间为2 h 时，UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 对目标物的吸附到达平衡。非印迹聚合物的吸附效果明显低于印迹聚合物的吸附效果。这主要是由于印迹聚合物的表面具有与目标物化学结构及形状相匹配的识别位点，而非印迹聚合物仅存在非特异性物理吸附，因此UCNPs@SiO2@MIP 比UCNPs@SiO2@NIP 对目标物有更高的吸附能力。

图2 印迹聚合物及非印迹聚合物动态吸附曲线Fig.2 Dynamic adsorption curve of imprinted polymer and non-imprinted polymer

2.3.2 静态吸附平衡试验 用UCNPs@SiO2@MIP对不同浓度的章鱼胺进行吸附，记录聚合物的荧光强度。

由图3 可知，随着章鱼胺浓度的增加，荧光分子印迹聚合物的荧光强度也增加，当章鱼胺质量浓度在2～10 mg/L 范围时，分子印迹聚合物的荧光增强程度（F/F0）呈现很好的线性关系。分子印迹聚合物的荧光强度与章鱼胺浓度的线性回归方程为Y = 0.0361X + 0.988，相关系数为0.995。当UCNPs@SiO2@MIP 为荧光传感器检测章鱼胺时，根据三倍信噪比计算得到的检出限为0.37 mg/L。

图3 UCNPs@SiO2@MIP 在不同浓度的章鱼胺溶液中的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence emission spectra of UCNPs@SiO2@MIP with addition of the indicated concentrations of OA

2.3.3 分子印迹聚合物特异性评价 为了评价分子印迹聚合物对目标物的选择性，选择组胺、色胺、酪胺作为结构类似物，质量浓度为8 mg/L，分别用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 对其竞争性吸附。如图4 可知，章鱼胺对UCNPs@SiO2@MIP 的荧光增强程度（F/F0）明显高于其它类似物的荧光增强程度；而对UCNPs@SiO2@NIP 的荧光增强程度与其它的类似物基本相同，主要是由于UCNPs@SiO2@MIP 印迹层中存在章鱼胺的识别位点，对章鱼胺具有更好的识别能力和选择性。

图4 UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP对OA、His、Tyr 和Try 的选择吸附Fig.4 Selective adsorption of OA，His，Tyr and Try by UCNPs@SiO2@MIP and UCNPs@SiO2@NIP

图5 UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP对OA、His、Tyr 和Try 的竞争性吸附Fig.5 Competitive adsorption of OA，His，Tyr and Try by UCNPs@SiO2@MIP and UCNPs@SiO2@NIP

为了进一步探究UCNPs@SiO2@MIP 对模板分子章鱼胺的识别能力及选择性，将质量浓度为8 mg/L 的章鱼胺溶液，章鱼胺和组胺混合溶液，章鱼胺溶液和色胺混合溶液，章鱼胺和酪胺混合溶液以及4 种生物胺混合溶液作为吸附溶液，分别用UCNPs@SiO2@MIP 和UCNPs@SiO2@NIP 吸附，测定吸附前、后的荧光强度，结果见图5。可以看出加入干扰物，荧光强度并没有发生明显变化，说明UCNPs@SiO2@MIP 对章鱼胺有较好的选择识别性。

3 实际样品检测

将所建立的荧光传感检测方法应用于黄酒和乳酪中章鱼胺的检测。由表5 可知，从黄酒和乳酪中均未检出章鱼胺，在4 个添加水平（0，2，4，8 mg/kg）下，章鱼胺的回收率为86%～98%，相对标准偏差（RSD）为0.54%～4.65%。

表5 荧光方法检测黄酒乳酪中OA 的添加回收率Table 5 The recovery of OA-containing samples by fluorescence analysis

4 结论

采用表面印迹技术合成具有高稳定性、高选择性、高灵敏度的荧光分子印迹聚合物UCNPs@SiO2@MIP。将其用于食品中章鱼胺的检测，快速、简便。