河蚬汤食源纳米颗粒对非酒精性脂肪肝长爪沙鼠的影响

余兆硕，汪惠勤，高观祯，柯李晶*，周建武，饶平凡，余陈欢

（1 中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心 杭州310035 2 中国科学院肿瘤与基础医学研究所实验动物中心 杭州310018）

河蚬（Freshwater clam，Corbicula fluminea）作为我国重要经济贝类之一，广泛分布于我国东南沿海地区。河蚬不仅肉质鲜美，其经蒸煮而成的河蚬汤也是东南亚地区自古用于保护肝脏的食疗验方。我国经典医书《唐本草》与《本草纲目》指出，河蚬为肝病防治的妙药。现代药理试验证实，河蚬汤可有效缓解化学性肝损伤，改善非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）[1]，并可通过降低丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的活化从而抑制活化巨噬细胞的炎症反应，调节机体免疫[2-3]。

目前，河蚬汤中分子组分的研究日益丰富，其脂肪酸组分可通过加快促进胆汁酸的肝生物合成，从而降低高脂血症大鼠的血浆胆固醇水平[4-5]。河蚬多肽对乙醇诱导的肝细胞损伤也有较显著的干预作用[6]。作为河蚬汤中的抗氧化成分，植物甾醇可增强血浆抗氧化能力[7]，促进脂质代谢，并可有效防止脂质过氧化造成的动脉粥样硬化。此外，不少学者从河蚬中分离提取出具有较强抗氧化能力的多糖[8-9]。然而，河蚬汤的主要有效组分尚不明确，且这些分子组分间协同互作关系仍未清晰。此前，已发现在简单蒸煮（沸水加热1 h）而成的河蚬汤中存在稳定的胶体体系[10]。随着热加工的开展，河蚬组织中细胞破裂，各成分有序迁移至水相，并组装形成天然食源纳米颗粒（Food nanoparticles，FNPs），其平均粒径约为76 nm，表面带负电荷，主要由多糖、蛋白质、脂质组成，且装载有植物甾醇、鸟氨酸、牛磺酸等小分子活性成分[11]，有望发挥护肝功效。至此，亟需验证河蚬汤FNPs 是否为河蚬汤生物活性的功能单元。

长爪沙鼠（Meriones unguieulataus，MU），因其脂质代谢在诸多方面与人体相接近，而被广泛作为脂质代谢研究的模型动物。考虑到FNPs 的尺寸，实验中设计了FNPs 的不同给药方式，探究口服与灌胃方式对机体的作用差异。研究河蚬汤食源纳米颗粒对于非酒精性脂肪肝动物的影响，有助于阐明河蚬汤的护肝机理，完善食品-人体互作机制，并促进食源纳米颗粒作为新型天然纳米生物材料的开发应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜河蚬，由台湾花莲立川水产场赠送；长爪沙鼠（SPF 级），购于浙江省动物科学研究所。

1.2 主要试剂

脂质含量（TG、TC）、肝功能指标（血浆及肝脏中谷草转氨酶AST 和谷丙转氨酶ALT）试剂盒，南京建成生物工程研究所；超滤管（分子量100 ku），美国Millipore 公司；氯仿、甲醇等（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；Milli-Q 超纯水，美国Millipore 公司。

1.3 主要仪器与设备

激光粒度仪Nano-ZS，英国Malvern 公司；荧光倒置显微镜（DMI3000 B），美国Leica 公司；多功能钙流检测工作站（FlexStation 3），美国Molecular Devices 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 河蚬汤及纳米颗粒的制备 将河蚬浸泡除沙2～3 h，洗净后按1∶1（m/V）比例与水混合，沸水煮60 min，收集剩余溶液，冷却到室温，21 500×g 离心15 min，除去沉淀，所得上清液即河蚬汤。将其分装后置于-20 ℃冷冻待用。取10 mL 新鲜或解冻后恢复常温的河蚬汤加到超滤管（100 ku）中，于5 000×g 离心转速下常温离心20 min。超滤管中截留的颗粒用Milli Q 水重悬，同样条件下再离心1 次，确保除去超滤管上吸附的非颗粒成分。最后将截留于超滤管上的颗粒同体积milli Q 水重悬，所得溶液为超滤截留纳米颗粒组分。

1.4.2 长爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型的构建

1）由浙江省医学科学院负责购买长爪沙鼠并进行环境适应饲养。

2）高脂饲料配方 80.5%的基础饲料与19.5%的高脂成分（蛋黄粉10%，猪油7%，胆固醇2%，3 号胆盐0.5%）。

3）长爪沙鼠经驯化后，对每只沙鼠称重并记录，按每5 只/组随机分组，每天9∶00 am 和4∶00 pm 按时喂食。

1.4.3 动物分组及给药 动物分组（4 组）：正常组（Control），河蚬汤纳米颗粒口服组（Oral），灌胃组（Gavage）及高脂组（HFD）。口服组，每天9∶00 am，按每只8 mL/d 给食，连续喂养4 周；灌胃组，每天3 次，按每只0.7 mL/次+自由饮水给食。实验喂食结束后，将各组沙鼠处死。所有的程序遵循浙江省医学院动物护理和使用委员会的标准（2016R10031）。

1.4.4 血浆及肝脏指标的测定

1）血浆中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的测定 使用含有肝素的注射器，从尾静脉采血，血样立即在4 ℃，400×g 离心10 min。收集的血浆须在12 h 内分析。按照酶法试剂盒方法检测。

2）AST 和ALT 的测定 取出0.2 g 肝脏研碎，注意低温、快速，随后加入4 mL 氯仿-甲醇混合萃取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），于4 ℃，1 500×g 离心10 min。取0.1 mL 上清液与0.1 mL Triton X-100充分混合，最后在氮气下蒸干溶剂。

3）肝脏组织切片染色 将剩余的沙鼠肝脏在4%多聚甲醛中浸泡固定3 d，取出后放入70%乙醇溶液中，取出脱水，石蜡包埋切片。片的厚度为6～10 μm。随后HE 染色，显微镜下观察。

1.4.5 数据处理与分析 数据结果以平均值±标准偏差（± s）表示，利用SPSS 20.0 软件对数据进行显著性检验，P≤0.05 或P≤0.01 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 河蚬汤FNPs 胶体性质

按河蚬与水1∶1（m/V）比例，煮沸60 min 的条件，得到呈乳白透明状的河蚬汤，采用动态光散射技术（Dynamic light scattering，DLS）检测其粒径。经超滤截留，河蚬汤中纳米颗粒粒径为（77.52±1.50）nm，ζ-电位为（-13.4±0.60）mV。

2.2 FNPs 对非酒精性脂肪肝长爪沙鼠血脂的影响

表1 与表2 显示，暴露在高脂饮食4 周后，高脂组长爪沙鼠肝脏各项指标均显著升高（P＜0.05），说明已成功建立非酒精性脂肪肝长爪沙鼠模型。与高脂肪组相比，灌胃组与口服组的长爪沙鼠血浆中TC 与TG 均有不同程度的下降，其中灌胃组和口服组的TG 水平下降不显著，而TC 水平均极显著下降（P＜0.01）。与正常组相比，口服组的TC 与TG 水平变化不显著。

2.3 FNPs 对非酒精性脂肪肝长爪沙鼠肝脏指数的影响

由表2 可看出，与高脂组相比，无论灌胃组还是口服组TC、TG、AST 与ALT 均不同程度地下降，其中肝脏中TC、AST 均极显著下降（P＜0.01）。与正常组相比，无论灌胃组还是口服组TC、TG、AST 与ALT 均无显著差异。同时，以上肝脏4 项指标中，在TC、TG、AST 等3 项指标，口服组均优于灌胃组，而口服组与灌胃组的ALT 指标并无显著差异。

表1 各组长爪沙鼠的血脂指数Table 1 Blood lipid level in MU of each group

表2 各组长爪沙鼠的肝脏指数Table 2 Hepatic index in MU of different groups

2.4 长爪沙鼠肝脏组织切片HE 染色观察

由图1 可看出，肝脏组织切片HE 染色结果显示：高脂组肝脏组织中出现明显的肝细胞上点状和灶状坏死，甚至有连片趋势。灌胃组中灶状坏死情况相比高脂组有所改善，而其胞浆内微小油滴仍清晰可见。口服组比灌胃组更接近正常组情况，无明显灶状坏死且组织形态更完整。

3 讨论

河蚬汤FNPs 可有效改善高脂环境诱导的高脂血症和非酒精性脂肪肝，说明FNPs 也是河蚬汤发挥护肝效应的重要组分。对FNPs 进行成分分析发现，FNPs 主要由多糖、蛋白质及脂质组成，且包含了鸟氨酸、牛磺酸及植物甾醇等具有护肝活性的小分子，这可能贡献了FNPs 的护肝效果。

图1 各组长爪沙鼠肝脏组织切片HE 染色Fig.1 Histochemical stains of MU liver sections of different groups

比较口服和灌胃两种方式对长爪沙鼠高脂模型的血浆和肝脏指数数据，发现两种喂食方式下，河蚬汤纳米颗粒均可明显地改善沙鼠脂肪肝状况。相比灌胃组数据，口服组长爪沙鼠的血浆和肝脏指数，特别在血浆TC，肝脏TG 上明显优于灌胃组（P＜0.05）。此外，从肝脏组织切片HE 染色结果也可看出明显差异。灌胃组沙鼠肝细胞上点状和灶状坏死明显比口服组沙鼠的多。也有研究表明，口服纳米化后的SOD 酶的降血糖作用优于灌胃处理[13]。口服和灌胃喂食最大的差异在于：口服直饮方式中，河蚬汤纳米颗粒从入口开始，就与口腔黏膜作用。相比于灌胃喂食方式，口服直饮方式的河蚬汤纳米颗粒有更多的时间和更大的接触面积作用于上消化道黏膜免疫细胞。纳米颗粒的作用方式有别于单分子成分经血转运并吸收作用的方式，其亦可直接被黏膜免疫吞噬细胞吞噬，从而发挥其生理活性作用。近来发现，食源性纳米颗粒可直接与口腔及腹腔黏膜的巨噬细胞相互作用，发挥调节胞内自由基的积极效应[14-15]，这说明食源性纳米颗粒与消化道之间的相互作用值得进一步探讨。

长爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型实验中，河蚬汤纳米颗粒经口服改善的肝脏指标显著优于经灌胃的肝脏指标，显示消化道黏膜可能是河蚬纳米颗粒发挥生理活性的主要场所。

4 结论

1）基于FNPs 作用于非酒精性脂肪肝长爪沙鼠的实验表明，FNPs 可显著降低血浆及肝脏中TC 及AST 水平，并不同程度地降低血浆TC、肝脏TG 及AST 水平，有效改善高脂血症及高脂诱导的非酒精性脂肪肝，说明FNPs 为河蚬汤护肝活性的功能单元。

2）FNPs 口服喂养效果优于灌胃喂养，这可能是FNPs 颗粒更易被上消化道黏膜细胞所捕获，从而发挥更强的生物活性作用。