中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜实时荧光PCR法鉴别及其应用

（秦皇岛海关技术中心，秦皇岛 066004）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1-4]。中国是养蜂大国，中国蜜蜂主要由意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera，简称意蜂）和中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）两大种群组成[5,6]。意蜂原产于欧洲和非洲，因有较高的生产性能，于20世纪初引入我国，现已成为我国饲养的主要蜂种[7]。中蜂是我国本土蜜蜂，已在中国繁衍了数千年，多为黑色，个体较意蜂小。中蜂所产的蜂蜜为中蜂蜂蜜，其营养价值高，保健功能好，但是由于产量低，价格是普通意蜂蜂蜜的3～5倍[8]。一些不法企业和养蜂人趁机将意蜂蜂蜜假冒中蜂蜂蜜销售，或将意蜂蜂蜜掺入到中蜂蜂蜜中以次充好[9,10]，这样不仅侵害了广大消费者的利益，而且破坏了公平竞争的蜂产品市场秩序。

因此，如何鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是当前蜂产品行业亟待解决的一大问题。前人研究发现中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在烷烃成分、王浆主蛋白种类方面存在较明显的差异，并建立了相应的鉴别方法。Won等发现王浆主蛋白MRJP1在中蜂和意蜂蜂蜜中具有不同的分子量和表面结构[11]。Won等和Zhang等分析了中蜂和意蜂蜂蜜中的差异蛋白并制备了特异性的抗体，通过免疫学方法对二者做了鉴别[10,12]。基于蜂蜡组分差异的鉴定方法也是确定蜂蜜蜂种来源的方法之一。Zuccato等利用1H-NMR方法分析了无刺蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的氯仿提取物，发现蜂蜡中的特异标记物可用来鉴别两种蜂蜜[13]。Zhang等发现中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的烃类特征性成分分别为三十五烯烃（17-Pentatriacontene）和三十一烷烃（Hentriacontane）[12]。

蜂蜜中含有蜜蜂的DNA，因此可用于蜂蜜的昆虫学来源鉴定[14,15]。以细胞色素C氧化酶为靶标基因，Kim等开发了一种双重PCR法来区分韩国本土蜂蜜和欧洲蜂蜜[16]。Soares等通过设计扩增tRNAleucox2间隔区的引物来鉴定中蜂蜂蜜，并通过建立16S rRNA靶基因的高分辨率熔解曲线来区分中蜂和意蜂蜂蜜[6]。Zhang等设计筛选了蜂种特异性引物，建立了用实时荧光PCR-SYBR Green染料法鉴别中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的体系，并发现该DNA分析不受蜜源植物种类和蜂蜜产地的影响[17]。为了提高检测方法的特异性，我们以MRJP2为靶标基因开发了实时荧光PCR-Taqman探针法[18,19]，通过设计特异性的引物探针来区分意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜，该方法操作更简便、检测更快速，并且灵敏度高、特异性强，可有效解决中蜂蜂蜜掺假问题，为维护市场秩序、保护消费者和相关蜂蜜企业的合法权益提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

引物与荧光探针购自江苏硕世生物科技股份有限公司，TaqmanTMGene Expression Master Mix（4369016）购自ABI公司。本文用于方法特异性和灵敏度分析的蜜蜂和蜂蜜样品直接由蜂农提供，用于中蜂蜂蜜真实性鉴别的样品主要购自淘宝网或京东商城，实时荧光PCR仪为ABI Steponeplus，PCR产物送至北京擎科新业生物技术公司进行测序。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜和蜜蜂DNA 的提取

取15g蜂蜜样品于50ml离心管中，加入30ml去离子水充分混匀，45℃温育5min，6000rpm 离心10min，弃上清，向沉淀中加入2ml超纯水，将沉淀充分悬起，转移至2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清，沉淀用于DNA提取，DNA提取按照CTAB法进行。用Nano Drop 2000C（Thermo）测定DNA浓度，蜜蜂DNA的提取参照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根，DP304）说明书进行。

1.2.2 引物探针设计软件

用Primer Express 3.0软件设计针对中蜂和意蜂的特异性引物探针，序列见表1。

表1 检测中蜂和意蜂的引物与探针

1.2.3 实时荧光PCR 反应

实时荧光PCR扩增体系为：2×TaqmanTMGene Expression Master Mix（ABI，4369016）12.5μl；ddH2O 7.5μl；上下游引物、荧光探针（10μM）各1μl；最后加入2μl的DNA模板，总体积为25μl。每个样品做两到三个平行，并设置阴性对照与空白对照。反应程序为：50℃ 2min，95℃ 10min；然后95℃ 15s，60℃ 1min，共45个循环。实时荧光PCR利用仪器自带的软件进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。

2 结果分析

2.1 实时荧光PCR检测方法的特异性分析

提取中蜂的基因组，分别用扩增意蜂和中蜂的引物探针进行PCR反应，结果发现仅用中蜂的引物探针有扩增，而用意蜂的引物探针无扩增，PCR产物测序表明为中蜂基因片段，说明中蜂引物探针具有特异性（图1A）。提取意蜂的基因组，分别用扩增意蜂和中蜂的引物探针进行PCR反应，结果发现仅用意蜂的引物探针有扩增，而用中蜂的引物探针无扩增，PCR产物测序表明为意蜂基因片段，说明意蜂引物探针具有特异性（图1B）。

图1 中蜂（A）和意蜂（B）实时荧光RT-PCR检测特异性分析

提取中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜基因组，分别用扩增意蜂和中蜂的引物探针进行PCR反应，结果发现两者无交叉扩增，进一步表明中蜂和意蜂引物探针具有特异性（图2）。

图2 中蜂蜂蜜（A）和意蜂蜂蜜（B）实时荧光RT-PCR检测特异性分析

2.2 实时荧光PCR检测方法的灵敏度分析

提取中蜂蜂蜜的基因组，测定DNA浓度为50ng/L，对DNA原液依次进行10倍稀释，共稀释4个梯度，每个稀释梯度取2L作为PCR反应的模板，每个稀释度设置三个平行，分别得到100、10、1、0.1、0.01ng样品的扩增曲线，结果显示中蜂蜂蜜的最低检测限为0.01ng（图3）。提取意蜂蜂蜜的基因组，DNA浓度为25ng/L，对DNA原液依次进行10倍稀释，共稀释4个梯度，每个稀释梯度取2L作为PCR反应的模板，每个稀释度设置三个平行，分别得到50、5、0.5、0.05、0.005ng样品的扩增曲线，结果显示意蜂蜂蜜的最低检测限为0.05ng（图4）。

图3 中蜂蜂蜜实时荧光PCR检测灵敏度分析

图4 意蜂蜂蜜实时荧光PCR检测灵敏度分析

2.3 市售中蜂蜂蜜的真实性鉴别

提取市售的54个中蜂蜂蜜样品基因组，分别进行中蜂和意蜂蜂蜜成分检测，每个样品做两个平行，结果发现20个样品为真实的中蜂蜂蜜，不含意蜂蜂蜜成分，占比为37%。32个样品均含有意蜂蜂蜜成分，其中24个样品为意蜂蜂蜜，不含有中蜂蜂蜜成分；另外8个样品为混合蜜，既含有中蜂蜂蜜成分，又含有意蜂蜂蜜成分，其中RS-13、19、32号样品以意蜂蜂蜜成分为主，RS-22、25、54号样品以中蜂蜂蜜成分为主，RS-14、24号样品意蜂和中蜂蜂蜜各占约50%。RS-40、49两个样品中蜂和意蜂蜂蜜成分均未检测到（表2）。

表2 对市售54个中蜂蜂蜜的检测结果

3 讨论

实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强的优点，在基因表达水平分析、多态性研究、物种特异性检测等方面具有广泛应用[20,21]。本文建立的实时荧光PCR方法对中蜂和意蜂蜂蜜DNA的最低检测限分别达0.01和0.05ng，采用CTAB法提取的蜂蜜DNA浓度一般为几十ng/μl，这与前人试验中的浓度2.3～303.9ng/μl基本一致[6]，因此完全可以满足检测的需求。Zhang等建立的普通PCR方法鉴别意蜂蜂蜜，检测限为0.1ng，灵敏度要比我们的略低[17]。提取的蜂蜜基因组中既含有花粉DNA，还含有蜜蜂DNA成分，本研究以真核生物18S rRNA基因为内参基因来判断蜂蜜DNA的提取效果，扩增Ct值在15～27，说明蜂蜜基因组提取效果较好。对中蜂蜂蜜掺假情况检测发现，市场上真实的中蜂蜂蜜仅占37%，其余均混杂不同比例的意蜂蜂蜜成分，说明中蜂蜂蜜掺假现象较普遍，严重破坏了公平竞争的市场秩序。本文建立的实时荧光PCR方法可为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的准确鉴别提供有效的技术支撑。此外，目前我们未对中蜂蜂蜜中的意蜂蜂蜜掺假比例进行详细研究，下一步将通过定量方法解决这一问题。