牡荆葡基黄酮对肺癌细胞恶性生物学行为及肿瘤生长的影响

陈鸿运，李晓明，黄国胜，杨金华，乔飞

（南阳医学高等专科学校第一附属医院普胸外科，河南南阳473000）

肺癌细胞侵袭和转移是肺癌形成的直接原因，在肺癌细胞转移过程中微管形成和间质细胞的增加会导致细胞形态、细胞内物质转移、细胞内信号转导等过程异常并最终形成肺癌[1]。目前，临床上肺癌的治疗方法主要有放化疗和手术切除，但治疗效果都不理想，且具有副作用。牡荆葡基黄酮（Vitexin）是一种芹菜素黄酮苷，主要存在于食用植物和药用植物中。研究表明，牡荆葡基黄酮通过抗氧化、抗炎症、抗癌、神经保护等生物活性在多种疾病及肿瘤预防中发挥重要调控作用[2⁃5]。Liu等[6]研究发现，牡荆葡基黄酮给药处理肺癌A549细胞会诱导细胞凋亡。赵培等[7]发现，牡荆葡基黄酮能抑制肺癌A549细胞侵袭和迁移，促进细胞凋亡。因此，本研究选择不同剂量牡荆葡基黄酮处理肺癌A549细胞，观察肺癌细胞侵袭和迁移，微管形成和间质转化，同时，利用裸鼠成瘤体内实验验证牡荆葡基黄酮给药治疗效果，探讨牡荆葡基黄酮在肺癌细胞中的调控作用，为牡荆葡基黄酮在肺癌中的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 细胞、试剂和仪器 牡荆葡基黄酮（质量分数≥98%）购自成都植标化纯生物技术有限公司；人肺癌A549细胞株由四川大学华西医院再生医学研究中心/卫生部移植工程和移植免疫重点实验室提供，将细胞放置在含10%（φ）胎牛血清（fetal bovine se⁃rum，FBS）、0.1 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培养液中，于37℃、5%（φ）CO2培养箱中培养；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Giboc公司；E⁃cadherin、N⁃cadherin抗体、免疫组化检测试剂盒PV⁃6000和DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司；Anti⁃Fibronectin Rabbit pAb购自武汉塞维尔生物技术有限公司；RT⁃6100酶标仪（Rayto）；D3024R台式高速离心机（DRAGONLAB）；MS⁃PB磁力搅拌器（Servicebio）；TSY⁃B脱色摇床（Servicebio）；BV⁃2电泳仪（Servicebio）；V370扫描仪（EPSON）；KE0003087移液枪（Dragon）；E100显微镜（Nikon）；Nikon DS⁃U3成像系统（日本尼康）。

1.1.2 实验动物 20只雄性SPF级Balb/c裸鼠，4～6周龄，体质量20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2017⁃0022。动物饲养条件：每只大鼠给予24 h昼夜灯光照射控制及严格、规范的卡片登记管理，24℃条件下独立饲养，建模前24 h小鼠禁食不禁水。

1.1.3 动物分组、建模及给药 将20只雄性Balb/c裸鼠随机分为对照组和给药组（n=10），将生长至对数期的肺癌A549细胞配制成2×105个/mL浓度的细胞悬浮液，取200μL细胞悬浮液接种到裸鼠皮下，建立移植瘤裸鼠模型，参照文献[8]给药组腹腔注射0.1 mL生理盐水（含Vitexin 2 mg/kg），对照组同时注射等量的生理盐水，持续4周。观察肿瘤体积，每5天用直尺测量1次肿瘤体积（体积=0.52×最长直径×最长横径），培养30 d后检测肿瘤质量。

1.2 方法

1.2.1 CCK8筛选Vitexin剂量 培养肺癌A549细胞株，待细胞90%融合后，用不同浓度的Vitexin处理细胞24 h后，将细胞铺入96孔板，每个浓度设置5个复孔，放入5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24 h。24 h后将配好的CCK8溶液按每孔10μL加入，37℃恒温箱内避光继续培养2～4 h，最后将96孔板放入酶标仪，450 nm处测定吸光度（A）值。

1.2.2 Transwell检测肺癌A549细胞侵袭能力 将不同浓度Vitexin处理的肺癌A549细胞株进行细胞转染24 h后，胰酶消化、离心并重悬细胞。基质胶和无血清培养基按1∶8（V:V）的比例混合均匀，加入transwell细胞小室中，小室上室加入不含胎牛血清的DMEM培养基，基质胶底层加入完全培养基，将细胞置于上室中培养30 min使其处于饥饿状态，然后将细胞小室置于37℃恒温箱中培养1 h。Tran⁃swell小室接种肺癌细胞（3×104/孔）检测细胞侵袭能力。24 h后取出细胞小室，多聚甲醛固定60 min后用结晶紫染色20 min，随机选取5～10个视野用显微镜拍照并计数。

1.2.3划痕实验检测肺癌A549细胞迁移能力 使用6孔板接种适量对数生长期的肺癌细胞，调整细胞密度至1×106个/孔，将6孔板放入培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，用不同浓度的Vitexin处理肺癌A549细胞24 h。24 h后去掉培养基用牙签在孔内均匀地划痕，加入无血清培养基进行培养并于划痕后0 h和24 h在同一位置观察拍照，分析细胞迁移距离。

1.2.4 成管实验检测肺癌A549细胞微管形成能力 实验前先将96孔板和枪头预冷，然后将50μL Matrigel加入96孔板中，放入37℃孵箱中0.5 h。用胰酶消化各组肺癌细胞并用ECM培养基重悬，以2×106个细胞种入96孔板中，12 h后显微镜下观察拍照，使用Image J计算分析微管结节数目。

1.2.5 Western blot检测E⁃cadherin、N⁃cadherin和FN表达水平 使用胰酶消化细胞，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。10%SDS⁃PAGE分离蛋白并转移至PVDF膜上，然后加入5%的脱脂牛奶室温封闭120 min。待封闭完成后，弃掉封闭液，加入一抗于4℃下封闭过夜。次日滴加二抗室温封闭60 min，最后加入ECL显色液曝光显影。独立重复实验3次，取平均值。

1.2.6 免疫组化检测E⁃cadherin和N⁃cadherin表达水平 按Envision二步法和免疫组化检测试剂盒（PV⁃6000）说明操作，将石蜡切片脱蜡至水，室温孵育5～10 min，用柠檬酸抗原修复缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，切片放入3%H2O2溶液中室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶，BSA封闭30 min，加入一抗孵育过夜，加二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50 min，DAB显色，苏木精复染。用PBS代替一抗作阴性对照。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出来的阳性信号为棕黄色。

1.3 统计学分析

使用SPSS17.0软件分析。正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）。多组数据比较采用方差分析，两两比较采用L S D法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK8筛选Vitexin剂量

用不同剂量Vitexin处理肺癌A549细胞株24 h，CCK8筛选合适的Vitexin剂量（图1）。不同浓度Vitexin浓度处理后，各组的细胞活力见图1。25μmol/L Vitexin处理后，细胞活力开始下降，50 μmol/L和100μmol/L Vitexin处理后细胞活力显著降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05），200μmol/L和400μmol/L Vitexin处理后细胞活力极低，太高浓度的Viteixin对细胞活力会产生强抑制性，导致无法观测影响作用，因此，50μmol/L和100μmol/L Vitexin为最佳药物观测剂量。

图1 CCK8筛选合适的Vitexin剂量Figure 1 CCK8 screening the appropriate dose of Vitexin

2.2 Vitexin对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

Transwell检测肺癌A549细胞侵袭数目，结果如图2所示，同一视野下各组侵袭细胞数目分别为Vitexin 0μmol/L（102±14）、25μmol/L（93±18）、50μmol/L（38±7）、100μmol/L（18±9）个。与Vitexin 0μmol/L组相比，25μmol/L Vitexin对肺癌A549细胞的侵袭没有明显抑制作用（P＞0.05），经50μmol/L和100μmol/L Vitexin处理后，肺癌A549细胞侵袭数量差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明Vitexin对肺癌A549细胞侵袭具有抑制作用，且呈剂量依赖性。

2.3 Vitexin对肺癌A549细胞迁移能力的影响

划痕实验检测肺癌A549细胞株迁移能力，与处理0 h相比，Vitexin处理24 h后各组均有明显的迁移，见图3A。24 h后细胞迁移率（%）分别为Vitexin 0μmol/L（78±7）、25μmol/L（74±8）、50μmol/L（57±6）、100μmol/L（35±9）。与Vitexin 0μmol/L组相比，Vitexin 25μmol/L组的迁移率差异不明显（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin处理后，肺癌细胞迁移率显著下降，且差异具有统计学意义（P＜0.05），见图3B。结果表明，Vitexin对肺癌细胞的迁移具有抑制作用，且呈剂量依赖性。

2.4 Vitexin对肺癌A549细胞微管形成的影响

成管实验检测肺癌A549细胞微管数目变化，结果如图4所示，各组微管节点数分别为Vitexin

0μmol/L（84±7）、25μmol/L（78±9）、50μmol/L（43±10）、100μmol/L（26±6）。与Vitexin 0μmol/L组相比，Vitexin25μmol/L组微管节点数无明显差异（P＞0.05），50μmol/L和100μmol/L Vitexin处理后，A549细胞微管数目显著减少，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明Vitexin抑制肺癌细胞微管形成，且呈剂量依赖性。

图2 Transwell检测肺癌A549细胞侵袭能力Figure 2 Detection of invasive ability of lung cancer A549 cells by Transwell

图3 划痕实验检测肺癌A549细胞迁移率Figure 3 Detection of the migration rate of lung cancer A549 cells by scratch test

图4 肺癌A549细胞株成管检测Figure 4 Tube formation of lung cancer A549 cells

2.5 Vitexin对 肺 癌A549细 胞E⁃cadherin、N⁃cad⁃herin、FN表达水平的影响

Western blot检测E⁃cadherin、N⁃cadherin和纤维黏蛋白的表达，结果如图5所示，各组E⁃cadherin蛋白表达水平分别为Vitexin 0μmol/L（0.06±0.03）、25μmol/L（0.07±0.04）、50μmol/L（0.24±0.07）、100 μmol/L（0.88±0.09），N⁃cadherin蛋白表达水平分别为Vitexin 0μmol/L（0.54±0.08）、25μmol/L（0.52±0.06）、50μmol/L（0.18±0.05）、100μmol/L（0.03±0.01），FN蛋白表达水平分别为Vitexin 0μmol/L（0.58±0.05）、25μmol/L（0.54±0.07）、50μmol/L（0.17±0.03）、100μmol/L（0.05±0.04）。与Vitexin 0μmol/L组相比，Vitexin 25μmol/L组E⁃cadherin、N⁃cadherin、FN蛋白表达水平差异均无明显差异。50μmol/L和100μmol/LVitexin给药处理后，E⁃cadherin、N⁃cad⁃herin、FN蛋白表达水平差异显著，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结果说明，Vitexin通过调节E⁃cad⁃herin、N⁃cadherin和FN蛋白表达抑制肺癌A549细胞间质转化。

2.6 Vitexin对肿瘤生长的影响

裸鼠成瘤体内实验检测Vitexin给药治疗效果，肿瘤体积变化如图6A所示。直尺测量30 d内肿瘤体积（5 d/次），结果如图6B所示，未给药组肿瘤体积（V/mm3）分别为25±9、68±15、215±65、518±84、1165±254、2314±387，Vitexin 2 mg/kg组肿瘤体积（V/mm3）分别为15±7、32±9、78±36、198±64、426±117、925±176。30 d后称取肿瘤质量，结果如图6C所示，未给药组肿瘤质量为（0.40±0.07）g，Vitexin 2 mg/kg组肿瘤质量为（0.15±0.05）g。与未给药组相比，2 mg/kg Vitexin给药治疗后，肿瘤体积明显变小，质量明显下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）。利用免疫组化检测裸鼠中E⁃cadherin和N⁃cadherin阳性细胞率，结果如图6D所示，E⁃cadherin阳性细胞率(%)分别为7±5、28±8，N⁃cadherin阳性细胞率分别为57±9、11±6。与未给药组相比，Vitexin 2 mg/kg显著增加E⁃cadherin阳性细胞率，减少N⁃cadherin阳性细胞率，且差异具有统计学意义（P＜0.05），结果说明Vitexin抑制肿瘤生长及间质转换。

3 讨论

牡荆葡基黄酮作为传统中药，具有天然无毒副作用、药效佳等特点，常用于心血管等疾病中，已有研究报道，牡荆葡基黄酮在肿瘤及癌症中具有调控效果[9⁃10]。本研究旨在探索牡荆葡基黄酮对肺癌细胞的侵袭和迁移、微管形成、间质转换及肿瘤生长的影响作用，为肺癌诊断与治疗提供新的药物。本研究结果显示，经中高浓度牡荆葡基黄酮处理后，肺癌细胞活力明显降低，与赵蓓等[7]的研究结果相符，结果提示牡荆葡基黄酮在肺癌细胞中具有调控作用。

图5 Westerrn blot检测E⁃cadherin、N⁃cadherin和FN蛋白表达水平Figure 5 Expression of E⁃cadherin,N⁃cadherin and FN protein by western blot

肿瘤细胞侵袭和迁移是肿瘤扩散及转移的前提条件，肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞通过其分泌的酶类物质突破附近细胞的外基质，入侵周围组织细胞，达到侵袭的目的。而肿瘤迁移是指肿瘤细胞依靠其运动及形变能力从一个组织或部位向另一个组织或部位移动的过程[11]。本研究结果发现，50、100μmol/L牡荆葡基黄酮能显著抑制肺癌细胞侵袭和迁移能力，且呈剂量依赖性。结果提示，牡荆葡基黄酮通过抑制肺癌细胞侵袭和迁移降低肺癌细胞活力。

图6 Vitexin对肺癌生长和EMT的影响Figure 6 Effect of Vitexin on lung cancer cell growth and EMT

微管是由微管蛋白和辅助蛋白组成的中空管状结构，在细胞分裂、细胞形态、物质运输及信号转导等过程中发挥重要作用。Yang等[12]研究发现，在肺癌细胞增殖过程中，微管通过聚合为纺锤体促进肿瘤细胞有丝分裂过程，同时，促进肺癌细胞侵袭和转移。Zheng等[13]也指出，微管介导并抑制自噬溶酶体的形成阻遏非小细胞肺癌细胞的侵袭。本研究结果显示，经牡荆葡基黄酮处理后，肺癌细胞微管数量明显减少，结果进一步说明牡荆葡基黄酮通过降低微管形成抑制肺癌细胞侵袭和迁移。

间质转换是上皮细胞向间质细胞转换的过程，上皮细胞结构稳定，胞间连接紧密且具有较强的细胞极性，而间质细胞则与之相反，胞间结构疏松，缺乏细胞极性，具有极强的侵袭和转移能力[14]。E⁃cadherin是上皮细胞紧密连接和稳定结构的重要调节蛋白，在上皮组织中往往高表达，同时抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[15]。N⁃cadherin和FN则与之相反，两者能够降低细胞间的黏附性，提高肿瘤细胞的运动能力，促进肿瘤细胞侵袭和远处转移[16⁃17]。研究发现，上调E⁃cadherin蛋白表达，下调N⁃cadherin蛋白表达能有效抑制间质转换过程[18⁃19]。吴安邦等[20]通过实验证实在非小细胞肺癌细胞中E⁃cadherin高表达，N⁃cadherin低表达。本实验结果显示，牡荆葡基黄酮下调N⁃cadherin和FN蛋白表达，上调E⁃cad⁃herin蛋白表达，且呈剂量依赖性。结果提示，牡荆葡基黄酮通过调节E⁃cadherin和N⁃cadherin蛋白表达抑制肺癌细胞间质转换过程和侵袭转移。

已有研究表明，牡基葡基黄酮对肺癌细胞恶性生物学行为具有抑制作用[6⁃7]，但牡荆葡基黄酮对肿瘤生长的影响及给药治疗效果未见报道，因此，本研究前期工作主要检测牡荆葡基黄酮在肺癌细胞侵袭迁移、微管形成和间质转换中的调控作用，为进一步明确牡荆葡基黄酮在肺癌中的药理作用，本研究利用裸鼠成瘤体内实验观测牡荆葡基黄酮对肿瘤生长的影响。结果显示，牡荆葡基黄酮给药治疗后显著抑制成瘤裸鼠肿瘤生长，同时抑制N⁃cadherin蛋白表达，上调E⁃cadherin表达。结果提示，牡荆葡基黄酮可作为肺癌诊断和治疗的潜在药物。

综上所述，牡荆葡基黄酮在肺癌细胞侵袭和迁移、微管形成、间质转换和肿瘤生长中具有抑制作用，但具体的抑制作用机制有待进一步研究。后续实验计划探究牡荆葡基黄酮在肺癌细胞中的作用机制，为牡荆葡基黄酮的临床应用提供更完善的实验基础。