测定吡虫啉农药制剂中有效成分的3种HPLC不同定量方法比较

李环亭，刘 黎，乔海清，王 婷，李建兵*，王晓滨，何培迎

（1.青岛市产品质量监督检验研究院，山东青岛 266101；2.国家海洋精细化工及其生物制品质量监督检验中心，山东青岛 266101；3.青岛市黄岛区检验检测中心，山东青岛 266555；4.江苏蓝丰生物化工股份有限公司，江苏新沂221400）

农药是人类生活中不可或缺的重要物资。近年来，随着人们环保意识的增强和对食品安全与健康的日益重视，农药生产不断发展和进步，农药在人类社会经济活动中发挥着越来越重要的作用[1]，农药质量也成为人们关注的焦点。农业农村部2018年农药监督抽查结果表明，有效成分不符合要求是农药质量不合格的主要问题之一，有效成分实际含量高于标签标示值[2]。农药有效成分含量的增加不仅会造成农产品中农药残留超标，危害人体健康，也会对生态环境造成一定的威胁，因此农药有效成分含量是监管的重点。

根据农药的物理化学及生物特性，农药产品的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、色谱质谱联用法、光谱法等[3]。目前吡虫啉有效成分含量测定的国家标准方法主要有GB 28126—2011《吡虫啉原药》、GB 28142—2011《吡虫啉可湿性粉剂》、GB 28143—2011《吡虫啉乳油》、GB 28141—2011《吡虫啉可溶液剂》、GB 28132—2011《吡虫啉微乳剂》，均采用单点校正法定量高效液相色谱法测定。单点校正法是通过已知浓度的标准样品与坐标原点做直线，对未知浓度待测组分进行测定，当待测组分的线性方程与坐标原点有较大差别时，单点校正法会出现较大的误差，而且单点校正法对标样称取、溶液配制、标样是否均匀的偶然误差无法分析，因此单点校正法对其给出的结果无法放进行判断[4]。标准曲线法通过配制标准工作曲线，定量时可以直接从标准曲线上读出含量，适合于大量样品分析，但如果用纯溶剂配置标准溶液来定量分析目标物，由于基质效应会造成检测结果与实际值之间会有偏差[5]，标准曲线法无法消除基质效应影响。标准加入法可以避免基质干扰，但操作比较复杂，对样品需求量较大[6]。

本文选取吡虫啉农药产品为研究对象，采用HPLC测定，采用单点校正法、标准曲线法和标准加入法3种方法定量，比较了不同定量方法对测定结果的影响。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent1200高效液相色谱仪（配紫外检测器），安捷伦科技有限公司；ML204T/02电子天平，瑞士梅特勒-托利多集团。

试剂：甲醇（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司。

标准物质：吡虫啉，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 液相色谱条件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，粒径5 μm），流动相甲醇∶水=40∶60，流速0.8 mL/min，进样体积10 μL，紫外检测器，检测波长260 nm。

1.3 标准溶液配置

1.3.1 单标储备液

称取0.1 g（精确至0.0001 g）吡虫啉标准物质于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，配制成1 mg/mL的单标储备液。

1.3.2 标准使用液

准确移取5.0 mL 1.3.1标准储备液于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，配制成0.1 mg/mL的标准使用液。

1.3.3 标准曲线法标准工作液

取1.3.1单标储备液和1.3.2标准使用液用甲醇逐级稀释成0.02～0.8 mg/L的标准工作液。

1.4 样品前处理

共选取7个不同厂家吡虫啉农药产品，包括10%可湿性粉剂4个，25%可湿性粉剂1个，5%乳油1个，10%乳油1个。

1.4.1 单点校正法前处理

分别称取2.0 g（标准质量分数5%）、1.0 g（标准质量分数10%）和0.4 g（标准质量分数25%）样品于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度线，然后准确移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，稀释10倍，过滤待测。取1.3.2标准使用液，按照标样溶液、样品溶液、样品溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.4.2 标准曲线法前处理

分别称取1.0、2.0、3.0 g（标准质量分数5%）；0.5、1.0、2.0 g（标准质量分数10%）；0.2、0.4、0.6g（标准质量分数25%）样品于50 mL容量瓶中，然后准确移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，稀释10倍，过滤待测。

1.4.3 标准加入法前处理

分别称取1.0、2.0 g（标准质量分数5%）；0.5、1.0 g（标准质量分数10%）；0.2、0.4 g（标准质量分数25%）各3组样品于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度线。准确移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，第2和3组样品再分别准确加入0.1 mg/mL标准使用液（1.3.2）2.5、5.0 mL，用甲醇定容至刻度线，过滤待测。

2 结果和讨论

2.1 方法重复性标准偏差

标准曲线法配制0.02～0.8 mg/L的标准曲线，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归分析，线性回归方程为y=46466.76x＋296.01，线性相关系数R2大于0.99。结果表明，在所测定浓度范围内，标准曲线线性良好。取10%吡虫啉乳油样品连续测定10次，结果见表1。单点校正法、标准曲线法和标准加入法重复性标准偏差分别为0.092、0.087和0.307，表明3种方法都适用于吡虫啉含量测定。

表1 单点校正法、标准曲线法和标准加入法重复性标准偏差

对表1中的数据进行单因素方差分析（F检验），F值为35.1，显著大于临界值（F(2,27)=3.35），表明3种定量方法间存在显著差异。采用F检验对上述3种方法的检测重复性标准偏差进行两两比较，结果发现标准加入法与单点校正法（p<0.001）和标准曲线法（p<0.001）有显著差异，单点校正法和标准曲线法两者间无显著差异（p=0.440＞0.05）。对任意2种不同定量方法测试结果的一致性采用t检验方法进行比较。有显著差异的2种定量方法，采用异方差假设的t检验方式；无显著差异的定量方法，采用等方差假设的t检验方式。检验结果表明，单点校正法与标准曲线法、标准加入法检测结果间存在显著差异（显著性水平α=0.05），标准曲线法和标准加入法之间无显著差异（显著性水平α=0.05）。

2.2 基质效应

基质效应是指样品中的其他成分对待测组分的影响。本文通过单点校正法、标准曲线法和标准加入法标准曲线来考察7种吡虫啉产品的基质效应，并对可湿性粉剂和乳油2种剂型不同的产品进行分析。采用t检验分析不同剂型的3种定量方法斜率的一致性，标准加入法、单点校正法与标准曲线法斜率比较的t值根据式（1）计算。结果表明，可湿性粉剂标准加入法、单点校正法与标准曲线法斜率统计量t值分别为4.36（＞t（25）0.05临界值=2.06）、13.49（＞t（16）0.05临界值=2.12）；乳油标准加入法、单点校正法与标准曲线法斜率统计量t值分别为1.01（＜t（17）0.05临界值=2.11）、17.18（＞t（15）0.05临界值=2.13）。标准加入法与单点校正法的斜率利用F检验和t检验进行分析（表2和表3）。结果表明，可湿性粉剂和乳油的p值均小于0.01。

式中：t为标准加入法或单点校正法与标准曲线法斜率的统计量；为标准加入法或单点校正法斜率平均值；μ为标准曲线法斜率；σX为标准加入法或单点校正法斜率标准差；n为标准加入法或单点校正法斜率测定次数。

表2 标准加入法和单点校正法斜率F 检验

统计发现，对于可湿性粉剂，标准加入法的斜率与标准曲线法、单点校正法的斜率有显著差异（置信水平α=0.05），说明可湿性粉剂的基质效应对定量结果的影响不可忽略，标准加入法定量可湿性粉剂的检测结果更可靠；对于乳油，单点校正法与其他两种方法的斜率有显著性差异（置信水平α=0.05），这可能是由于单点校正法在测量过程中根据产品标签确定称样量，但样品标称含量与实际含量是有差别的，实际测量过程中待测组分与标准样品的响应值不可能完全一致，采用单点校正法会产生较大误差[4]。标准加入法的斜率与标准曲线法的斜率没有显著差异（置信水平α=0.05），说明本文检测的乳油基质效应对测定结果的影响不显著，但标准加入法操作过程较为复杂，样品需要量大，在处理大量样品或者对农药产品进行监督抽查时，会影响检测效率，同时需要大量的标准品，可采用标准曲线法定量更快速准确。

2.3 3种定量方法测定结果t检验

为了研究3种定量分析方法在检测不同产品时的差异，本文对7个不同厂家的产品分别用单点校正法、标准曲线法和标准加入法进行了检测，检测结果采用成对二样本平均值的t检验两两进行显著性检验。结果表明，在显著性水平α=0.05时，可湿性粉剂产品3种方法定量结果都有显著性差异（p＜0.05）（表4）；乳油产品标准曲线法和标准加入法定量结果没有显著差异（p=0.95＞0.05），但单点校正法与另外2种方法测试结果都存在显著差异（p＜0.01）（表5）；这可能是单点校正法会受到标样称取、配置等操作引起的偶然误差，部分产品还会受到组成、待测成分等因素导致相应信号与其量的线性关系与标物响应与标物量的线性关系偏离；标准曲线法受环境影响较大，其截距偏离较大时会与单点校正法有显著差异，标准加入法解决了样品组分、基质等因素的影响[4]。

表4 吡虫啉可湿性粉剂3 种定量方法测定结果t 检验

表5 吡虫啉乳油3 种定量方法测定结果t 检验

3 结 论

本文利用HPLC法对不同剂型不同含量的吡虫啉农药产品进行测定，通过单点校正法、标准曲线法和标准加入法进行定量分析，对3种方法的标准偏差、基质效应和测定结果进行了F检验和t检验。结果表明，对吡虫啉可湿性粉剂产品，标准加入法曲线斜率与单点校正法和标准曲线法具有显著性差异，为消除基质效应对检测结果准确性的影响，建议选择标准加入法进行定量分析；对吡虫啉乳油产品，由于单点校正法与标准曲线法和标准加入法的标准偏差具有显著性差异，单点校正法只有在标准曲线截距较小时才可使用，应用受限，且标准加入法操作较为复杂，因此选择标准曲线法进行定量分析，以节省时间，同时满足各类检测要求。不同定量分析方法对农药制剂产品有害成分的检测有影响，相关农药产品的国家、行业标准在制定过程中需要考虑不同定量分析方法对测定的影响，以确保农药有效成分检测的准确性。