地道云南知竹酒活性成分含量测定

郭继英，俞为民，阚永清，朱建敏，吕昊宁，白柔柔，李田钊

（墨江地道酒业有限公司，云南普洱 654800）

地道云南知竹酒是以优质米香型白酒为基础酒，加以墨江黑竹萃取液、枸杞子、大枣、黄芪、西洋参材等配制而成，具有清凉、化痰等保健功能。此方为云南民间验方，本研究旨在合理开发利用该方，进行了3 批次的预生产调试试验，并拟对其产品进行质量控制研究。因此，本研究以黑竹萃取物中的没食子酸[1]，枸杞子中甜菜碱[2]，大枣中绿原酸、芦丁[3-4]，黄芪中黄芪甲苷[5]及西洋参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1[6]为指标成分，并参考惠小娜等[7-8]的研究方法，建立了以UPLC-MS/MS 法测定了地道云南新产品知竹酒中甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素的含量，以期为该产品的标准制定和质量控制提供参考、为民间验方的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：3批地道云南知竹酒（均为开发研究试制产品，厂家：墨江地道酒业有限公司，批号：20170412A、20171005A、20171218A）。

试剂与耗材：甜菜碱对照品（批号：110894-200503，纯度：100.0 %），中国药品生物制品检定所；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201616，纯度：97.4%）、芦丁对照品（批号：100080-201610，纯度：91.9 %）、人参皂苷Rg1 对照品（批号：110703-201731，纯度：93.6%）、人参皂苷Rd 对照品（批号：111818-201603，纯度：92.1%）、人参皂苷Re对照品（批号：110754-201827，纯度：93.4 %）、人参皂苷Rb1 对照品（批号：110704-202028，纯度：93.1 %）、没食子酸对照品（批号：110831-201605，纯度：90.8%），中国食品药品检定研究院；槲皮素对照品（批号：100081-200907，纯度：96.5%），中国食品药品检定所；甲醇（色谱纯），美国Fisher 公司；甲酸（色谱纯），美国Tedia 公司；实验室用水为Mili-Q超纯水，德国Merck 公司。

仪器设备：1290 高效液相色谱仪，美国Agilent公司；G6430 三重串联四级杆质谱仪（美国Agilent公司），XS205DU 十万分之一电子分析天平，瑞士Mettler 公司；3-18KS 高速台式冷冻离心机，德国SIGMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液制备

精密称取甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素对照品适量，加50 %甲醇分别制成0.937mg/mL、1.095mg/mL、0.975mg/mL、1.082mg/mL、1.105mg/mL、1.079mg/mL、0.822mg/mL、1.002mg/mL、1.061 mg/mL 贮备液。分别取各对照品溶液适量，置于同一100 mL 量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素的混合对照品溶液，质量浓度分别为23.42 μg/mL、0.05475 μg/mL、9.75 μg/mL、5.410 μg/mL、5.525 μg/mL、21.58 μg/mL、16.44 μg/mL、20.04 μg/mL、1.061 μg/mL。

1.2.2 供试品溶液

取地道云南知竹酒适量于PE 管中，置离心机中，10000 r/min离心10 min后，取上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.3 空白样品溶液

取白酒基酒，按“1.2.1”项下方法制备空白样品溶液。

1.2.4 仪器测试条件

色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）；流动相：水（A）-0.1 %甲酸乙腈（B），梯 度 洗 脱（0～3 min，10 % B；3～4 min，10 %→30 % B；4～5 min；30 %→50 % B；5～7 min，50 %→70 % B；7～10 min，90 % B；10～11 min，90%→10%B），流速为0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：采用电喷雾正离子（Electronic spray ion,ESI+）和负离子切换电离源模式（Electronic spray ion,ESI-），扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）；雾化气压力：30 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：9 L/min；ESI+模式时毛细管电压为4000 V；ESI-模式时毛细管电压为3500 V；MRM 模式定量。9 种活性成分的电离方式、分子量、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 线性关系、定量限和检测限

精密量取“1.2.1”项下混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法，用50%甲醇分别稀释5倍、10倍、20倍、100 倍、200 倍，制得5 个不同浓度梯度的系列溶液，按“1.2.4”项条件下分别进样测定3 次，记录峰面积。以对照品待测液浓度（x）为横坐标，峰面积平均值（y）为纵坐标，进行回归，再将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N=10、S/N=3 时的质量浓度作为定量限和检测限，结果见表2，各成分在各自范围内线性关系良好。由检出限和定量限结果可以看出，本方法灵敏度较高。

表1 9种待测活性成分质谱条件

表2 9种成分的回归方程、线性范围、相关系数、LOQ 和LOD

2.2 精密度试验

将同一对照品溶液按“1.2.4”项条件进样测定6次，测得甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素峰面积RSD，分别为1.08 %、3.23 %、1.92 %、1.81 %、1.88 %、3.59 %、2.30 %、2.44 %、2.05%。结果表明，仪器精密度良好。

2.3 色谱和质谱条件优化

本试验考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1 % 甲酸乙腈-水等流动相条件，发现0.1%甲酸乙腈-水条件下各组分均可以达到较好的分离和峰形；在优化质谱条件时，发现人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd的准分子离子峰并不是简单的[M+H]和[M-H]，在正离子模式全扫描时出现了[M+NH4]+、[M+H]+、[M+Na]+和[M-H2O+H]+等准分子离子峰，在负离子检测时则均出现了[M＋45]-，推测其为[M＋HCOO]-或[M+2Na-H]-等离子，试验结果与郭继芬等[9]的研究报道一致，因此本试验选择人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re 在负离子模式下[M＋45]-作为检测用准分子离子峰；本试验选择在正负离子切换扫描模式下优化所得质谱条件，甜菜碱在正离子模式下有较高的检测灵敏度，其余各组分在负离子模式下均显示出较高的检测灵敏度。优化所得9 种活性成分UPLC-MS/MS 色谱图结果见图1，由图1可知，9种活性成分分离良好无干扰，且峰形较好。

2.4 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号20170412A），于室温下放置0、2 h、6 h、12 h、24 h 后在“1.2.4”项条件下进样测定，根据甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素色谱峰面积计算RSD，分别为1.32 %、1.30 %、1.67 %、2.37 %、1.27 %、3.62 %、1.4%、2.53%、1.60%。结果表明，该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

取同一批样品（批号20170412A），按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液6 份，在“1.2.4”项条件下进样测定，测得地道云南知竹酒中甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素含有量，计算RSD分别为1.15 %、3.63 %、2.38 %、2.58 %、2.08 %、3.93%、1.71%、3.34%、2.60%。结果表明，该方法重复性良好。

图1 多反应监测模式下9种活性成分UPLC-MS/MS色谱图

表3 回收率测定结果(n=3)

2.6 加样回收率试验

分别精密取0.1、0.5、1 mL 混合对照品溶液各3份于PE 管中，于40 ℃氮气吹干，分别精密加入同批次含有量已知的地道云南知竹酒（批号20170412A）10 mL，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.4”项条件下进样测定，计算回收率。9种活性成分的回收率为89.9 %～104.2 %，表明该方法回收率良好。结果见表3。

2.7 样品含有量测定

取不同批号地道云南知竹酒3 批，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.4”项条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。结果表明，所测3 批地道云南知竹酒试制产品中，甜菜碱含量最高，其次是人参皂苷Rd 和人参皂苷Rb1，各批次间9 种成分的RSD在1.69%～8.84%，各成分含量较稳定。

3 结论

经方法学考察验证，本试验建立了UPLC-MS/MS 法同时测定地道云南知竹酒中甜菜碱、没食子酸、芦丁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷、槲皮素的含有量。该方法简便快速、专属性强、灵敏度高，所选指标成分涉及每一味配伍药材，质量控制较全面。为地道云南知竹酒质量控制及产品质量标准的制定奠定基础，为进一步开发利用该产品提供了理论依据。

地道云南知竹酒的产品开发研究不仅丰富了配制酒的品种，而且对该民间验方进行合理有效运用，同时产生一定的经济效益且带动地方经济发展。

表4 样品测定结果(μg/L，n=3)