九宫香菊挥发油的抑菌活性

杨萍，李莎，张颖，吴光英，陈科力，李娟*

湖北中医药大学/教育部中药资源与中药复方重点实验室（武汉 430065）

菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRamat.）的干燥头状花序，为药食两用的大宗商品，在我国栽培及药用历史悠久。史载于《神农本草经》[1]，有散风清热、清热解毒、平肝明目的功效，常用于治疗外感风热所致头痛、身热；肝阳上亢所致头痛眩晕；肝火上攻所致目赤肿痛等。然而，目前对菊的研究和利用主要集中在花序上，对其非药用部位的研究和资源化利用较少，造成巨大的浪费，并对环境造成污染。据报道，菊花采摘后的根、茎、叶中也富含黄酮类、有机酸类等各类资源性化学成分[2]，对其开发利用，有助于资源合理应用，变废为宝。

植物挥发油作为一种绿色安全的天然提取物，其有效成分具有抗氧化、抗病毒和抗菌等多重药理作用，可应用于果蔬、肉类等食品保鲜领域[3-5]。现代药理研究表明野菊花、衡水湖黄顶菊叶的醇提物，怀菊、洋甘菊、滁菊、昆仑雪菊、神农香菊、黄山贡菊等的挥发油提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有一定的抑制作用。九宫香菊采集于湖北咸宁市通山县九宫山，因其管状花白色、单性、富含侧柏酮，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为菊科菊花的一种栽培种，命名为九宫香菊Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel. cv.‘Jiugong Xiangju’.，品种鉴定的相关内容已发表[6]。同时，前期研究发现九宫香菊在储存过程中，较不易霉变和生虫，因而此次试验分别提取九宫香菊花干品与鲜品的头状花序（药用部位）与茎叶（非药用部位）的挥发精油，分析比较其抑菌活性和成分，为后续研究及开发提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与菌种

菊花全草，收集于湖北本草汇农业开发有限公司，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为菊科的菊；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），湖北省工业微生物菌种保藏与研究中心；大肠杆菌（Escherichia coli），华中农业大学动科院胡敏教授惠赠。

1.2 仪器与试剂

高温高压灭菌锅，日本三洋公司；电子秤，奥豪斯仪器（常州）有限公司；分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；气质联用仪，赛默飞世尔科技公司；恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；恒温箱，上海齐欣科学仪器有限公司；MH培养基、LB培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；对氯间二甲苯酚，上海麦克林生化生化科技有限公司；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma公司；乙醚，色谱级，MREDA。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 醇提液的制备

称取50 g干菊花头状花序粉末，用10倍量的75%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并滤液，抽滤，旋蒸定容至50 mL容量瓶，质量浓度为1 g生药/mL。

2.1.2 挥发油的制备

称取200 g菊花鲜品及干品的茎叶和头状花序粉末，分别用水蒸气蒸馏法提取其挥发油10 h，蒸馏液经氯化钠饱和，用乙醚萃取3次，上层萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，低温蒸馏回收乙醚，得到一种有特殊清香气味的黄色油状物。

2.2 菌液的制备

将分离保存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于琼脂培养基培养活化，将典型菌落接种至LB培养基中，于37 ℃培养24 h，用培养液配制成与0.5麦氏比浊管浊度相同的浓度为1.5×108CFU/mL的菌悬液，备用。

2.3 抑菌作用的测定

2.3.1 纸片扩散法

取定量滤纸，经打孔器将滤纸制成直径6 mm的滤纸圆片，高压灭菌，干燥。将含药的滤纸圆片置于涂有100 μL菌悬液的平板上，细菌置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察菌落生长情况，采用十字交叉法测定抑菌圈两个垂直方向的直径，每个试验平行3次，取其平均值作为测定结果。以DMSO为阴性对照，以1.5%对氯间二甲苯酚为阳性对照。

2.3.2 最小抑菌浓度（Mic minimum inhibitory concentration，MIC）测定[6]

采用微量肉汤二倍稀释法。样品初始浓度为800mg/mL，在96孔板中1～9号孔依次进行二倍递减浓度稀释，然后接种稀释约为1.0×106CFU/mL菌液，10号孔仅加培养基作为阴性对照，11号孔内加入培养基和菌液作阳性对照，12号孔加入终浓度为1.5%的对氯间二甲苯酚溶液和菌液作阳性药对照。制备完毕后将培养板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察结果。黑色背景下肉眼观察，阴性对照孔溶液应清晰透亮，阳性对照孔细菌生长良好，此时以溶液清晰透亮的最低浓度孔中的药物浓度为MIC。

2.3.3 最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）测定[7]

确定MIC后，取清晰无菌生长孔中的培养物转接种于MH琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24h，用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落，平均数小于5个的最小药物浓度即为此药的MBC。

2.4 GC-MS试验条件

2.4.1 样品处理

取0.2 mL挥发油，用乙醚定容至2 mL，经0.22 μ m微孔滤膜滤过。

2.4.2 气相色谱条件

色谱柱：TG-5M石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为纯氦气（He），流量1.0 mL/min；进样量1.0 μL；分流比5∶1；进样口温度250 ℃。升温程序：初始温度50 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min的升温速度升至250 ℃，保留5 min。

2.4.3 质谱条件

电子轰击（EI）电离源；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；扫描质量范围m/z50～500；溶剂延迟时间4 min。

3 结果与分析

3.1 菊花不同处理部位纸片扩散法药敏试验结果

以对氯间二甲苯酚为阳性对照，用纸片扩散法测定菊花各不同处理部位的抑菌作用，抑菌圈越大，抑菌效果越明显。无抑菌圈者为不敏感，抑菌圈直径＜12 mm为低度敏感，抑菌圈直径12～20 mm为中度敏感，抑菌圈直径＞20 mm为高度敏感。从图1和表1可以看出：菊花醇提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均无明显抑菌作用；菊花挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显大于对大肠杆菌的抑制作用，且剂量与药效具有线性相关性；菊花茎干和花的挥发油中鲜品的抑菌效果较干品强；鲜茎叶的抑菌效果与干花无明显差异，而鲜花挥发油的抑菌效果最好，几乎与阳性药相似。

3.2 MIC测定结果

九宫山鲜菊花、鲜茎叶、干花、干茎叶挥发油对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为6.25，25，12.5和100 mg/mL。

3.3 MBC测定结果

九宫山鲜菊花、鲜茎叶、干花、干茎叶挥发油对金黄色葡萄球菌的MBC值分别为12.5，25，25和200 mg/mL。

3.4 GC-MS测定结果

九宫山鲜菊花、干菊花及鲜茎叶挥发油的提取率分别为0.3%，1.12%和0.25%。将提取得到的鲜花、干花和鲜茎叶挥发油经过GC-MS分离鉴定，总离子流图如图2所示。通过色谱峰谱库进行数据检索并解析，用归一化法测定出各主要组分的相对百分含量，结果见表2和表3。结果表明，九宫香菊鲜品与干品挥发油中的主要成分相似（主要为侧柏酮、桉树脑、4-萜烯醇、左旋樟脑、桧烯等），相对含量差别较小；茎叶挥发油所含主要成分与花序挥发油相比略有区别（主要为侧柏酮、1-石竹烯、4-萜烯醇、桉树脑、4-萜烯醇、左旋樟脑等），1-石竹烯含量相对更高，而无桧烯等成分。

图1 九宫香菊提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性

表1 九宫山菊的茎叶和花挥发油的药敏试验结果（±s，n=3） 单位：mm

表1 九宫山菊的茎叶和花挥发油的药敏试验结果（±s，n=3） 单位：mm

注: 各组挥发油浓度均为800 mg/mL。

分组 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌鲜菊花 19.67±0.47 9.63±1.24鲜茎叶 17.00±0.82 8.33±0.94干菊花 17.67±0.47 9.30±1.30干茎叶 12.50±1.00 7.67±0.62 1.5%对氯间二甲苯酚 20.00±0.82 13.00±0.47

图2 菊花干花（a）、鲜花（b）和鲜茎叶（c）挥发油的总离子流图

表2 鲜菊花挥发油化学成分信息表

接表2

表3 九宫山菊的茎叶和花挥发油主要成分相对含量分析 单位：%

4 讨论与结论

九宫香菊轻嗅有一种特异的香气和清凉感，这可能与其含有桧烯、桉树脑、左旋樟脑、右旋龙脑、萜品烯、β-蒎烯和石竹烯等具有精油特征香气成分有关[9]，其中右旋龙脑是在菊花中报道较少的成分。植物挥发油具有广谱的抗菌活性，可作为天然抗菌剂，不同的植物挥发油化学成分不同，其抗菌活性也存在差异，九宫香菊花及其茎叶挥发油中因含有β-蒎烯、桉树脑、右旋龙脑等成分而具有抑菌活性[10-14]。

此次试验发现，该菊花干品与鲜品的药用部位（花序）及非药用部位（茎叶）均具有一定的抑菌活性，它们的主要成分组成差异不大。虽然鲜花的抗菌活性相对更强，但是茎叶产量远高于花序，挥发油含量和抗菌活性仅略低于花序，如在产地就地提取茎叶挥发油，将有利于菊花资源在食品、医药等行业的充分利用，具有极大的开发潜力和良好的应用前景。