应用离子液体逆流色谱系统分离制备金银花中的绿原酸

张伟，董红敬，刘伟，王晓，刘峰*

齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心（济南 250014）

金银花是药食同源的食物，具有清热解毒、凉风散热的功效[1]，还具有保肝利胆、提高免疫力等作用[2]。绿原酸是金银花质量控制的标志化合物[1]，具有调节糖脂代谢、抗菌、抗肿瘤、抗炎等活性[3-6]，在食品、药品、化妆品等领域具有广泛应用。绿原酸是由咖啡酸与奎宁酸缩合生成的缩酚酸，是一种高极性的天然化合物，易溶于甲醇、丙酮等有机溶剂[7]，易氧化，同分异构体较多，分离纯化难度较大。目前绿原酸的制备工艺主要采用大孔树脂预纯化，制备液相[8]、聚酰胺层析精制[9]等方法。但这些方法对样品的吸附作用是不可逆的，对溶剂的要求较高。

高速逆流色谱（HSCCC）是一种液-液分配色谱，能有效避免样品分离时出现不可逆吸附、变性失活等情况，已被广泛应用于天然产物的分离中[10-14]。采用HSCCC分离高极性化合物，通常使用正丁醇-水为基础的溶剂系统，这类系统在逆流色谱柱中固相保留率较小，且容易流失，影响分离效果。文献[15]报道，用V（正丁醇）∶V（甲酸）∶V（水）=4∶1∶5溶剂系统经2次高速逆流色谱分离得到94.8%绿原酸，但该溶剂系统保留值较低，分离效率差。离子液体是一类在室温或接近室温下呈液体的盐类，具有稳定性好、挥发性弱、不易燃易爆、溶解度大、可重复利用等特点[16]。咪唑类离子液体可与含有羟基和羧基的有机酸分子形成氢键等作用力[17]。因此，在高速逆流色谱溶剂系统中，加入咪唑类离子液体可以使有机酸分布在有机相中，增大有机酸在上相中的分配，从而实现有机酸的分离。

此次试验拟考察离子液体[C6min][PF6]（结构式见图1A）对绿原酸在乙酸乙酯-水两相溶剂系统中分配系数的影响，从金银花中分离制备绿原酸（化学结构式见图1B），以期为HSCCC分离高极性天然活性物质提供新的理论支持。

图1 [C6min][PF6]和绿原酸的结构式

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药材购于当地药店，经山东中医药大学李佳教授鉴定为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾。乙酸乙酯、乙醇（均为分析纯，天津广成化学试剂有限公司）；甲酸（分析纯，山东宏仕德化工有限公司）；[C6min][PF6]（分析纯，上海成捷化学有限公司）；乙腈（色谱纯，山东禹王试剂有限公司）；水（高纯水）。

1.2 仪器与设备

GS10A高速逆流色谱仪（北京新技术研究所）；S系列柱塞式泵（北京圣益通技术开发有限公司）；8823B型紫外检测仪（北京宾达英创科技有限公司）；Waters 600高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Varian INOVA-600核磁共振波普仪（美国Varian公司）；Agilent 5973N质谱仪（美国Agilent公司）。

1.3 绿原酸粗提物的制备

根据文献[18]方法，略作修改。取1.0 kg金银花，粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，时间分别为2，2和1 h，用旋转蒸发仪在50 ℃浓缩。由于提取物中会有大量的黄酮类化合物，根据绿原酸与黄酮类化合物的极性差距，黄酮类化合物在乙酸乙酯中的溶解度要远远大于绿原酸在乙酸乙酯中的溶解度。将浓缩液用蒸馏水稀释至1 000 mL，用乙酸乙酯萃取2次（萃取体积比为1∶1），去除提取物中黄酮等化合物。再向水溶液中加浓HCl调pH至3.0～4.0，然后用乙酸乙酯萃取，此时绿原酸主要集中在乙酸乙酯相中[18]，浓缩乙酸乙酯萃取物后得20.5 g绿原酸粗提物，放置于冰箱内冷藏，待用。

1.4 溶剂系统的选择

以V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5为基础溶剂系统，向此溶剂系统中加入不同比例的[C6min][PF6]，混匀，平衡。取2 mg绿原酸粗提物置于试管中，分别加入2 mL上下相，超声，待样品完全溶解后，用高效液相色谱法测定样品在上下相的浓度，上相峰面积与下相中的峰面积之比即为绿原酸在该溶剂系统中的分配系数KD。

1.5 两相溶剂系统及样品溶液的配制

溶剂系统为V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5，按比例置于分液漏斗中，充分振荡，静置12 h，分取上下相，待用。将样品用上相和下相各3 mL溶解，待用。

1.6 高速逆流色谱分离

按所选溶剂系统，以一定比例在分液漏斗中混匀、静置12 h，用前将上下相分开。首先以9.0 mL/min的流速将上相泵入色谱柱，待色谱柱注满后，开启速度控制器，转速调为800 r/min，然后用1.0 mL/min的流速泵入下相，待系统平衡好后，开启六通阀，将溶有样品的上下相混合液注入柱色谱。打开检测器，在254 nm下检测流出组分。收集色谱峰组分，用HPLC分析样品纯度。

1.7 色谱条件

采用Waters C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m），流动相为乙腈-水（0.2% HCOOH）。洗脱梯度：0～15 min，10%乙腈；16～35 min，10%→100%乙腈；36～40 min，100%乙腈。流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm。

2 结果与分析

2.1 溶剂系统的选择

目标化合物在逆流色谱两相体系中的分配系数（KD）是筛选高速逆流色谱溶剂分离系统的关键，其最佳KD值范围在0.5～2.0之间[19]。通过向V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶剂系统中加入不同比例的[C6min][PF6]，绿原酸在上下相中的分配系数会发生改变，表1是不同添加量的[C6min][PF6]离子液体对绿原酸分配系数的影响。在V（乙酸乙酯）∶V（水）=5∶5的溶剂体系中绿原酸的KD值为0.32，采用此两相溶剂系统对样品进行分离，高速逆流色谱图及HPLC分析如图2所示。采用此溶剂系统，固定相保留率为35%，绿原酸峰（图2A阴影部分）与其它色谱峰分离度较差，不能分离得到绿原酸纯品（图2B）。从表1可以看出，绿原酸在V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5和V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.8 2个两相溶剂系统中的KD值分别为0.70和0.77，KD值较为理想。

表1 绿原酸在不同溶剂系统中的分配系数

图2 金银花浸膏乙酸乙酯/水体系高速逆流色谱图

2.2 HSCCC分离结果

考虑到试验成本因素，首先选用V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5为两相溶剂系统，采用1.6小节的方法，从金银花粗提物中分离得到高纯度绿原酸，体系固定相保留率为45%，高速逆流图如图3A（阴影部分为绿原酸）所示。经HPLC分析（图3B），其纯度为97.5%。V（乙酸乙酯）∶V（水）∶V（[C6min][PF6]）=5∶5∶0.5为最佳两相溶剂系统。

离子液体在水相中有一定的溶解度并且在溶液中不易除去，大孔树脂HPD-100对高极性化合物[C6min][PF6]的吸附能力很差，对绿原酸有一定的吸附性，试验将HSCCC流出液经大孔树脂HPD-100精制，20%乙醇洗脱，去除绿原酸中的[C6min][PF6]，然后用90%的乙醇洗脱，可得到绿原酸纯品。经过上述过程，300 mg的金银花粗提物可得到30 mg的高纯度绿原酸。

2.3 [C6min][PF6]改变溶剂系统分配系数机制探讨

单独测定绿原酸及将10 mg [C6min][PF6]放入含有5 mg绿原酸的核磁共振管中，通过1H NMR的研究，根据绿原酸分子链上各质子化学位移的变化，即可推断出绿原酸与[C6min][PF6]的作用位置。结果显示，绿原酸中羧基H信号消失，而苯环上的3′-OH和4′-OH化学位移较大，分别为0.022和0.026×10-6（如表2所示）。这说明当含有[C6min][PF6]溶剂系统中存在绿原酸时，羧基的氧原子与[C6min][PF6]中的咪唑环之间存在静电力；同时，苯环上的羟基氢原子与离子液体的阴离子之间存在氢键作用力。这两种力量相互作用有利于有机酸从水相中进入离子液体相（有机相），向V（乙酸乙酯）∶V（水）=1∶1两相溶剂系统中加入不同比例的[C6min][PF6]，可改善绿原酸在两相溶剂系统中的分配系数，从而促进化合物的分离。

图3 金银花浸膏乙酸乙酯/水/[C6min][PF6]体系高速逆流色谱图

表2 绿原酸及绿原酸与[C6min][PF6]混合后1H NMR化学位移

2.4 化合物的确定

峰Ⅰ：白色粉末，ESI-MSm/z377[M+Na]+；1H NMR（DMSO，600 MHz）δ：1.74（2H，m，H-2），5.05（1H，dt，J=8.4，3.6 Hz，H-3），3.55（1H，m，H-4），3.92（1H，m，H-5），1.97（2H，m，H-6），7.01（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.72（1H，d，J=7.2 Hz，H-5′），6.96（1H，dd，J=7.2，1.8 Hz，H-6′），7.42（1H，d，J=16.8 Hz，H-7′），6.13（1H，d，J=16.8 Hz，H-8′），与文献[20]对照，确定为绿原酸。

3 结论

以乙酸乙酯-水为基础系统，向溶剂系统中添加离子液体[C6min][PF6]，改善了绿原酸在两相溶剂系统中的分配，并通过1H NMR阐述了其作用机制。通过此研究，可以证实离子液体能改善高极性化合物在逆流色谱的溶剂系统的分配，从而实现高极性化合物的分离，这拓宽了HSCCC分离天然产物的应用范围。