廿一味植物药改善小鼠睡眠质量及早期安全性研究

姜其慧，王云杰，王存芳，邓金祥，余炳胜，李幼贞，庞涛

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：ICR小鼠，雄性，体质量25～28 g，购自南京江宁区青龙山实验动物繁育中心，每只小鼠使用一次。饲养于中国药科大学药学动物实验中心清洁型动物房，动物房保持温度(22±3)℃,相对湿度(55±3)%，采用12 h昼夜节律控制，保持食物和水源充足，适应环境3 d进行实验。(2)仪器：Varioskan Flash全波长酶标仪(美国ThermoFisher)；R500通用型小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司)；一次性1 ml注射器(河南省欧冠医疗器械有限公司)；小型秒表计时器(上海皓元股份有限公司)；(3)药物：廿一味植物药是一种廿一味中药植物复方功能制剂，由广东隆赋药业股份有限公司生产提供的成药(批号：190401)，属于夜用装。戊巴比妥钠购于上海信裕生物科技有限公司。异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟基丁酸脱氢酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、尿素(UREA)等检测试剂盒均购自于上海科华生物工程股份有限公司。

1.2 实验方法 将104只ICR小鼠分为3个实验组：安全性实验24只，戊巴比妥钠阈上剂量睡眠实验40只，戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验40只。每个实验组按照体质量随机分为4亚组，分别为阴性对照(CN)亚组(生理盐水)，廿一味植物药低剂量亚组(0.1 g/kg)、中剂量亚组(1 g/kg)、高剂量亚组(2 g/kg)。灌胃给药，将廿一味植物药溶于适量生理盐水，分别配制成低、中、高剂量，保持小鼠灌胃体积为0.2 ml，阴性对照亚组灌胃给等量生理盐水，连续给药28 d，随小鼠生长体质量变化而调整给药。

1.2.1 安全性实验：每周测定并记录各亚组小鼠体质量。末次给药后1 h，使用小型动物麻醉机麻醉小鼠，摘取眼球收集血液，静置2～3 h后，在4 ℃离心机离心收集血清，根据试剂盒说明书，检测各脏器毒性指标。其中肝脏毒性指标为ALT、TC、TG，心脏毒性指标为AST、LDH、CK及α-HBDH，肾脏毒性指标为UREA；将小鼠安乐死，取心、肝、脾、肺、肾、脑等各亚组小鼠脏器，称质量，计算并脏器系数，脏器系数=脏器质量/体质量×100%，同时取各脏器进行脱水固定及HE染色。

1.2.2 戊巴比妥钠阈上剂量睡眠实验[5]：末次给药30 min后，各亚组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg(戊巴比妥钠使用生理盐水配制，现配现用，所有小鼠100%入睡的最低剂量)，记录小鼠从给药后到翻正反射消失的时间，即为睡眠潜伏期；并记录各亚组小鼠的睡眠时间，观察廿一味植物药对戊巴比妥钠引起的睡眠潜伏期和睡眠时长的影响。

1.2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验[6]：末次给药30 min后，各亚组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg(戊巴比妥钠使用生理盐水配制，现配现用)，记录各亚组小鼠翻正反射消失即入睡的只数，并计算睡眠发生率(睡眠发生率=入睡小鼠只数/各亚组小鼠总只数×100%)，比较廿一味植物药不同剂量对戊巴比妥钠阈下小鼠入睡发生率的影响。

1.3 统计学方法 采用Graph Pad Prism 6统计软件进行数据分析。表格计量数据以均值±标准差(Mean±SD)表示，图计量数据以均值±标准误(Mean±SEM)；多组间比较均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 安全性实验

2.1.1 廿一味植物药对小鼠体质量的影响：实验开始前，各亚组小鼠称质量，给药期间每周称质量。与阴性对照亚组相比，各亚组小鼠在不同时间段体质量均无明显差异(P>0.05)，即廿一味植物药对各亚组小鼠体质量的增长均无影响。见表1。

表1 各亚组小鼠28 d体质量变化比较

2.1.2 廿一味植物药对小鼠脏器系数的影响：随着ICR小鼠生长周龄的变化，小鼠的脏器质量和体质量逐渐增加，但各亚组小鼠的脏器系数(脏器系数=脏器重量/体质量×100%)并无明显差异(P>0.05)。见图1。

图1 各亚组小鼠的脏器系数比较 (n=6)

2.1.3 廿一味植物药对小鼠脏器毒性的影响：与阴性对照亚组相比，各浓度的廿一味植物药对肝脏毒性指标ALT、TC、TG，心脏毒性指标AST、LDH、CK、α-HBDH及肾脏的毒性指标UREA均未产生明显影响(P>0.05)。见图2。

图2 各亚组小鼠的脏器毒性指标比较 (n=6)

2.1.4 HE染色结果：HE染色观察不同剂量廿一味植物药对小鼠脏器的影响，结果发现，与阴性对照亚组相比，不同剂量给药组心脏心肌细胞结构完整，心肌纤维排列紧密，细胞核质紧密，心肌毛细血管无扩张充血现象；肝脏染色结果正常，细胞细胞核居中且大而圆，可以看到明显核仁，肝小叶形态完整，无明显变化。脾脏滤泡数量丰富，形态饱满，脾窦形态完整，窦内无坏死细胞和炎性细胞浸润。肺部组织结构正常，肺泡完整，支气管黏膜上皮及肺泡无变形，无炎性细胞渗出及聚集。肾脏切片在显微镜下可见结构形态正常，肾小球形态正常，球后毛细血管无扩张充血现象。脑部组织神经元结构完整，无明显形态变化，且无大量炎性细胞浸润。见图3。

图3 各亚组小鼠各脏器的HE染色切片(×40)比较

2.2 廿一味植物药改善小鼠睡眠质量的作用分析

2.2.1 戊巴比妥钠阈上剂量睡眠实验：在使用戊巴比妥钠阈上剂量条件下，与阴性对照亚组相比，廿一味植物药高、中、低各剂量均可明显缩短小鼠进入睡眠的潜伏期(P<0.001)，且高、中、低各剂量可明显延长各亚组小鼠的睡眠时间(P<0.001)，说明廿一味植物药在改善睡眠方面与戊巴比妥钠具有协同作用。见图4。

注：与阴性对照亚组比较，aP<0.001

2.2.2 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验：在使用戊巴比妥钠阈下剂量条件下，与阴性对照亚组相比，廿一味植物药高、中剂量可明显增加小鼠入睡的数目，明显升高小鼠睡眠发生率(P<0.05)。见表2。

表2 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

3 讨 论

廿一味植物药夜用装主要由21味植物药材组合而成，与本课题之前研究的廿一味植物药日用装在药材组成上略有不同。其中有15味药材组成相同，主要包括薤白、茯苓、葛根、木耳、山楂、肉桂、栀子、枸杞子、黄精、沙棘、金针菇、桂圆、白芷、甘草、乌药叶。在这些相同成分中，葛根具有悠久的药食两用历史，对神经有明显的保护作用[10]；栀子的主要成分栀子黄色素具有清心除烦、治疗心肾不交的功效，可治疗虚烦不眠、惊悸多梦，具有改善睡眠的作用[11]。肉桂属樟科常绿乔木植物，中华本草中记载[12]，肉桂具有增加冠状动脉及脑血流量的作用，通过改善脑血流量起到神经保护作用，改善睡眠，且肉桂挥发油中桂皮醛具有镇静作用。桂圆、枸杞子性甘干无毒，是养脑益智上品[13]。这些相同药材是廿一味植物药实现保健品功能的基础。

廿一味植物药夜用装与日用装中有6味药材组成不同。夜用装中含有酸枣仁、百合、莲子、黄花菜、橘皮、白果，而日用装中含有桃仁、藿香、人参、丁香、干姜、菊花。本课题组之前的研究发现日用装可通过增加脑源性神经营养因子和抗氧化作用进而起到改善记忆的作用[14]。而夜用装中，百合味甘，性微寒，具有养阴润肺、清心安神的功效[15-16]，百合作为中药临床上广泛治疗各种失眠症状。酸枣仁属于中药养心安神药，为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，味甘酸，性平，归心肝经，有养心益肝、安神敛汗之功效[17]，可治疗虚烦不眠、惊悸多梦。酸枣仁味酸性平，有润肺安神敛汗之效[18]；莲子又名水芝丹，属睡莲科莲属，主要分布在福建等地[19]，莲子性味甘寒无毒，具有安神解热之功效[20]。黄花菜又名金针菜，古书记载“安五脏，利心志”，可治“夜少安寐”；黄花菜的乙醇提取物可通过强化小鼠大脑衍生神经营养因子系统和5-HT系统，进而表现为抗抑郁和促睡眠作用[21]。白果的主要成分是白果内酯，具有改善脑动脉血流量的作用[22]。这几种中药组合使用，其复方制剂夜用装可起到益气补血、安神益脑的作用。

目前，受试药物与巴比妥类联合给药检测睡眠时间等指标是最经典的药理方法。通过观察小鼠的睡眠潜伏期，睡眠时间及小鼠的入睡发生率等指标检测实验药物的催眠作用。但由于戊巴比妥钠经过肝药酶代谢，对肝药酶有影响的药物可能会延长睡眠时间等。因此还需进一步检测戊巴比妥钠阈下剂量实验的动物入睡发生率，进一步确定受试药物的催眠作用。本研究参照《保健食品检验与评价技术规范》的有关睡眠功能实验改善后进行实验。在戊巴比妥钠阈上睡眠实验中，与阴性对照亚组相比，廿一味植物药夜用装高、中、低各剂量亚组可明显缩短小鼠的睡眠潜伏期，延长小鼠睡眠时间。在戊巴比妥钠阈下催眠实验中，与阴性对照亚组相比，廿一味植物药夜用装高、中剂量亚组可明显提高小鼠的睡眠发生率，实验证明廿一味植物药夜用装可起到协同戊巴比妥钠改善睡眠的作用。并且在连续28 d的灌胃给药后发现，与阴性对照亚组相比，廿一味植物药夜用装高、中、低各剂量亚组小鼠体质量均无明显变化，脏器系数、脏器毒性指标检测并无明显变化，且各亚组小鼠HE染色切片显示并无明显病理变化。

综上所述，廿一味植物药夜用装具有改善睡眠的作用，并且在早期安全性评价中安全，无不良反应，具有开发保健食品及临床用药的潜力。