表面增强拉曼光谱技术在外泌体检测中的研究进展

林慧晶，吴 琼，陈冠楠，陈 荣，林 多

（医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建省光子技术重点实验室，福建师范大学，福州 350007）

外泌体是胞内体与细胞膜融合后释放到细胞外的脂质双层囊泡，直径大约在30～150 nm，广泛分布于血液、尿液、唾液、羊水、母乳和腹水等体液中。外泌体最早是Johnstone等［1］在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现的。外泌体最初被认为只是细胞的“垃圾袋”，用于清除不必要的成分，这导致与其相关的研究沉寂了二十多年。直到2007年，Valadi等［2］首次报道外泌体也含有核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并对其组成和功能进行了深入的研究，使得外泌体成为生命科学研究领域的热点。现如今我们知道，外泌体携带着其来源细胞的各种分子成分，包括蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）和非蛋白质编码小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）等（图1），可以在细胞间转移，因此被视为细胞间通信的一种重要模式［3］。越来越多的证据表明，癌症衍生的外泌体可以转移致癌活性并调节血管生成、免疫和转移，以促进肿瘤的发生和发展［4-9］。外泌体作为细胞间信息传递的载体，存在于各种体液中，尤其是在疾病标志物筛选中起了重要的作用［10-11］。因此，外泌体是一种极具潜力的非侵入性癌症筛查、癌症进展评估和治疗反应监测的生物标志物。

图1 外泌体结构示意图Fig. 1 Structure of exosomes

目前，外泌体的检测技术［12-14］主要包括：透射电镜、蛋白质免疫印迹技术（Western blot， WB）、酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技术、流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析技术、动态光散射技术以及基因测序技术。这些分析技术极大地推动了外泌体的研究进程，但也存在着一些局限：ELISA需要大量高度浓缩的样品，无法实现复杂样本的快速分析［15］；纳米颗粒跟踪分析技术对外泌体浓度的测量范围有限（每毫升只有106到109个）［16-17］；流式细胞术分析外泌体可能存在回收信号弱等问题［18］；透射电镜检测、PCR与TamSeq二代测序技术则存在检测费用昂贵、操作步骤复杂、耗时等不足。总之，目前外泌体分析检测仍然没有“金标准”，因此，急需进一步发展外泌体检测新方法，加快癌症体液活检的发展进程。

拉曼光谱是一种基于非弹性散射的分子光谱技术，能够识别蛋白质、核酸、脂肪等生化物质分子［19］。但在实际应用中，目标分子固有的拉曼散射截面极小，并且目标样品的荧光信号强，常常造成常规拉曼信号微弱，被淹没在荧光信号中［20］。直到1974年，Fleischmann等［21］科学家发现，表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）可以将吸附在粗糙金属表面的待测物拉曼信号增强103～1015倍，实现单分子检测，同时还能淬灭生物样品的自体荧光信号，极大地增强了拉曼光谱的信号。目前，科学界对SERS的增强机理还未给出一个清晰统一的解释，普遍认为SERS效应是由物理增强与化学增强共同作用的结果［22-23］。物理增强主要是电磁场增强，分析物吸附或靠近粗糙的贵金属表面时，受金属表面等离子体共振导致局域电磁场增强。化学增强由电荷转移引起，分析物吸附或足够靠近金属表面，通过电荷转移产生增强现象。尽管SERS的增强机理复杂尚需进一步探索，但是SERS技术已广泛应用于多个领域，这归功于SERS技术在生物样品检测方面具有的独特优势：1）超高灵敏度，实现待测物的痕量分析；2）不受水溶液信号的干扰，可检测液体状态下的样品；3）有效淬灭生物样品自体荧光，获取高质量拉曼光谱。SERS技术广泛应用于生物医学的各个领域［24］，如核酸、蛋白质、人体细胞、人体组织以及人体体液的检测。

近年来，人们开始尝试将超高灵敏度的SERS技术用于外泌体的检测，试图发展一种高效、无损的液体活检新技术［25］。基于SERS技术的外泌体检测策略可分为两种：一种是无需引入拉曼探针的非标记SERS技术，直接获得外泌体自身的拉曼信号，该方法的优势是简单快速，可以更直接分析外泌体的成分，但各类生物分子的信号有可能互相重叠，造成部分诊断信号的丢失；另一种是标记SERS技术，利用拉曼探针分子对外泌体进行标记，通过检测标记分子的拉曼强度，间接检测外泌体的存在以及浓度，该方法常常有着更高的检测灵敏度和特异性。本文主要介绍SERS在外泌体中的非标记和标记检测的发展进程，并且展望了SERS在外泌体中的应用前景。

1 SERS技术对外泌体的非标记检测

非标记检测是将纯化后的外泌体直接吸附或非常靠近SERS基底表面获取外泌体的拉曼光谱信号。为了获取理想的外泌体拉曼信号，需要制备高效的SERS增强基底。

2012年，Tirinato等［26］利用光刻技术刻蚀规则六角形图案形成超疏水表面，用于检测从正常结肠细胞和结肠癌细胞分离出来的外泌体。超疏水表面可有效聚集液滴，与光学共振现象相结合，增强了SERS光谱信号。结果表明，从正常细胞中提取的外泌体呈现出与脂质振动相对应的较高的峰值强度，而从肿瘤细胞系中提取的外泌体则表现出较丰富的RNA含量。超疏水表面将外泌体浓缩到基底的活性区域，方便了SERS对生物样品进行极精确的分析和表征。2015年，Lee等［27］利用溅射技术在3D纳米碗表面涂覆一层银膜作为SERS基底，用于检测卵巢癌细胞的外泌体随时间推移的SERS信号。这一3D纳米碗用于检测外泌体具有独特的优势：首先，与还原法制备的银纳米粒子相比，溅射等离子体表面具有更低的SERS背景信号；其次，外泌体在早期保持完整的形态，通过SERS可检测外泌体膜表面的蛋白与脂质，随着碗内的水分蒸发至干涸，外泌体破裂时，可检测到外泌体内容物的SERS光谱。2017年，该小组继续开展相关研究［28］，利用表面修饰巯基肽配体的银纳米颗粒对具有α3ß1高表达的卵巢癌外泌体进行特异性捕获。随着靶向特异性配体库的发展，该方法可以从富含外泌体的体液中选择性地发现和分析目标外泌体，是一项在早期疾病检测方面极具潜力的技术。2017年，Sivashanmugan等［29］将银纳米立方体组装在金纳米棒阵列表面热环直径上形成等离子间隙模式SERS阵列底物来研究外泌体。他们利用所开发的SERS基底，研究了正常肺细胞和癌细胞的外泌体，发现肺癌外泌体的较强SERS信号主要是来源于蛋白质，而正常外泌体的SERS信号主要来源于蛋白质、脂质和核酸等生物分子。同年，Miquel等［30］发现在常规记录盘（CD-R和DVD-R）上涂覆薄银层后可以显著增强拉曼光谱信号，这主要与聚碳酸酯结构、银厚度和激发波长有关。他们在经过试验后获得了无标记的血红蛋白和外泌体的SERS光谱，这表明了该方法的生物传感潜力。该方法的最大优势是SERS基底制备简单、费用低并且易于大规模制备。

以上介绍的外泌体SERS检测平台均是基于银纳米颗粒。而金纳米粒子相对于银纳米粒子具有更好的生物相容性，基于金纳米颗粒的外泌体SERS检测在近年来也得到了显著的发展。2014年，Laura等［31］应用SERS技术初步研究了卵巢癌细胞在正常氧气条件下和缺氧条件下的外泌体组成分差异。2016年，Stremersch等［32］制备了一种带正电荷的金纳米粒子，由于静电吸附会使得金纳米粒子与囊泡（囊泡包括外泌体）吸附在一起，增强拉曼信号。他们利用偏最小二乘法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）与多元曲线分辨率交替最小二乘法（multivariate curve resolution alternating least squares，MCR-ALS）分析算法分析得到的拉曼光谱数据，能够区分来自正常细胞和癌细胞的囊泡。2017年，Park等［33］将SERS技术和统计算法相结合，发展了一种无标记、高灵敏度的外泌体分类方法。此次试验以金纳米粒子为SERS增强基底，采用主成分分析方法分别对肺癌细胞与正常细胞分泌的外泌体的光谱进行分析，判别灵敏度为95.3%，特异性为97.3%。2018年，Carmicheal等［34］利用非标记SERS技术联合主成分微分函数分析（principal component differential function analysis，PCDFA）算法对来源于胰腺癌和正常胰腺上皮细胞分泌的外泌体进行区分，判别准确率可达90%。他们进一步将这种方法应用于血清中外泌体的检测分析，同样获得了理想的效果，有望发展一种胰腺癌早期检测新方法。想要利用非标记SERS检测技术达到分辨外泌体的目的，除了需要制备具有显著增强效果的SERS基底之外，还需要发展更高效的数据处理方法。2020年，Shin等［35］利用计算机深度学习对来自正常细胞系和肺癌细胞系的外泌体的SERS信号进行了训练，并提取两类外泌体光谱的特征后建模用于分析和预测人血浆来源外泌体的SERS光谱。该试验将外泌体的SERS光谱分析与深度学习相结合，成功地鉴定了肺癌患者，甚至发现了处于第一阶段的病人。该方法无创、安全、灵敏，对肺癌早期液体活检方法的发展具有重要意义。

非标记SERS技术展示了外泌体自身的“指纹”图谱后，再利用多元统计及计算机深度学习算法对其深入挖掘诊断信息并建立判别模型，最终实现区分和追溯不同来源的外泌体。当前，非标记SERS外泌体检测技术向临床转化的过程中面临重重困难，但是我们相信随着外泌体研究样本的数量的扩大和相关技术的发展，该方法极有可能被广泛用于临床检测中。

2 SERS技术对外泌体的标记检测

SERS标记检测是一种将SERS光谱技术与抗体抗原特异作用相结合的纳米标记免疫分析技术。SERS纳米标记是一类含有强烈拉曼信号的等离子体纳米粒子。通过类似抗体抗原的特异反应作用使得SERS纳米标记与目标外泌体相结合形成“三明治”复合物，再通过检测此复合物的拉曼标记分子的拉曼强度，间接表征目标分子的分布和浓度。常见的“三明治”结构主要可以分为两类：一类是“拉曼探针-外泌体-磁珠”（图2），另一类是“拉曼探针-外泌体-芯片”（图3）。

图2 “拉曼探针-外泌体-磁珠”结构类型示意图［36］Fig. 2 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-magnetic beads”［36］

2.1 “拉曼探针-外泌体-磁珠”SERS检测模型

通常，与正常细胞相比，肿瘤细胞会分泌更多的外泌体，并且其膜表面有特殊的生物标记物（主要是一些跨膜蛋白），这使得肿瘤源性外泌体成为一种重要的癌症生物标记物。因此，研究人员就利用肿瘤源性外泌体含有多种特异性蛋白的特点，设计了一系列“拉曼探针-外泌体-磁珠”SERS检测模型。如图2所示，该方法通常使用两种纳米颗粒——磁性纳米珠和SERS纳米探针，且在两种粒子表面修饰有两种特异性抗体，可以单独识别外泌体上的两种不同的蛋白质。在靶向外泌体的存在下，SERS纳米探针、外泌体和磁性纳米粒子之间形成了“三明治”型免疫复合物。在有磁铁的情况下，免疫复合物可以沉淀，因此SERS纳米探针将在沉淀中检测到SERS信号。而在没有靶向外泌体的情况下，由于不能形成免疫复合物，沉淀只有磁性纳米颗粒，SERS信号几乎检测不到。这样，SERS信号可以用来判别目标外泌体的存在。近年来，越来越多的人发现标记SERS在外泌体研究中的应用潜力，其中“拉曼探针-外泌体-磁珠”SERS检测模型引起了一大部分人的兴趣。

图3 “拉曼探针-外泌体-芯片”结构类型示意图［43］Fig. 3 Structural type diagram of“Raman probe-exosomes-chip”［43］

2016年，Zong等［36］提出了利用磁性纳米粒子和核-壳结构纳米探针来识别和捕获靶外泌体，形成“三明治”型免疫复合物，实现对靶外泌体的定性和定量检测，其检测极限比其他大多数报道的方法都要低。其中，磁性纳米粒子是先在Fe3O4纳米粒子表面包覆一层二氧化硅，然后在二氧化硅表面附着抗体制备而成的。拉曼探针是以银包金纳米棒（gold core-silver shell nanorods，Au@Ag NRS）为激发核，然后修饰上染料分子作为拉曼报道分子，再包裹上硅层，最后在硅层表面修饰抗体。该方法可以直接从细胞培养基中检测出外泌体，无需其他复杂的操作，且检测极限低于其他报道的方法。因此，与现有外泌体检测方法对比，SERS的检测方法简单、省时，是一种分析和检测肿瘤外泌体的有效方法。2017年，该课题组又提出了一种同时多重检测外泌体的方法［37］。为了识别三种不同癌细胞分泌的外泌体，在金纳米粒子表面修饰三种对应的适配体及拉曼报道分子制备成捕获探针。上清液中存在有三种探针，当一种目标外泌体被加入，就会与相应的磁珠和探针特异性吸附，复合物在磁铁作用下被聚集到管子底部。这时，上清液中这种外泌体的捕获探针明显减少，对应的这种探针的拉曼峰明显减弱。为了验证该方法的实用性，试验最后采用从乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的患者体内获得的真实血液样品进行检测。2018年，Tian等［38］再次证明“拉曼探针-外泌体-磁珠”结构类型的SERS生物传感器具有相当大的潜力，可以作为便捷和高灵敏度的量化工具，以检测生物样品中的外泌体。2019年，Zhan等［39］基于带负电的DNA四面体和带正电的Au NPs之间静电吸引的原理，开发出一种将金纳米粒子组装在四面体上的新型拉曼探针（assembling gold nanoparticles in triangular pyramid DNA，TP-Au NPs）。这种带有强电磁热点的传感器可极大增强SERS信号。人乳腺癌细胞MCF-7外泌体上的上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）含量很高，因此在检测外泌体时，可选择EpCAM适配体和胆固醇修饰的DNA用于识别和富集外泌体。首先，链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的EpCAM适配体反应，捕获富集外泌体。其次，胆固醇修饰的DNA与TP-Au NPs SERS探针杂交，并且SERS探针上附着的胆固醇与外泌体脂质膜之间的疏水相互作用进而识别外泌体，形成类似“三明治”结构。该方法可以有效区分从健康个体和乳腺癌患者血浆中提取的外泌体。循环外泌体PD-L1可作为预测抗PD-1/PD-L1的临床疗效指标。2020年，Pang等［40］提出了一种可以直接从血清中捕获和分析PD-L1外泌体的方法。首先，由于TiO2壳能与外泌体上磷脂分子的亲水性磷酸“头部”结合，因此可以利用Fe3O4@TiO2纳米颗粒来富集外泌体。其次，加入PD-L1抗体修饰的Au@Ag@MBA-SERS标记探针，对PD-L1外泌体进行定量标记。根据该方法，仅需使用4μL临床血清样品即可精确定量外泌体PD-L1，整个过程可在40 min内完成。

鉴于miRNA在基因表达转录后的调控中起到至关重要的作用，miRNA已被视为癌症检测的潜在生物标志物。外泌体脂质双层的性质可以避免miRNA降解，使得外泌体中的特异性miRNA非常适合作为癌症早期诊断和预后的生物标志物。一般标记SERS技术检测外泌体核酸的模型类似“三明治”结构，miRNA链连接在探针与磁珠间，但是由于此时磁珠体积明显比探针大，磁珠外表面均可以连接核酸与探针，因此形成了核卫星结构。2018年，Ma等［41］发展了一种基于双链特异性核酸酶辅助循环放大的SERS方法，用于定量检测人血液中外泌体的miRNA。2019年，Pang等［42］再一次验证了双链特异性核酸酶辅助循环放大的SERS生物传感器的可行性。该试验方法在核酸酶辅助下进一步放大信号，可以实现单碱基识别的检测限，并且不需要多次洗涤和杂交，适合于临床诊断。

2.2 “拉曼探针-外泌体-芯片”SERS检测模型

标记SERS在外泌体的定性与定量研究中极具潜力。试验中，外泌体的分离与富集方法除了考虑如上述一样使用磁珠之外，还可以考虑使用SERS芯片。利用外泌体上的两种不同的蛋白质，然后在基板和探针上分别修饰两种特异性抗体，在靶向外泌体的存在下，可以在探针、外泌体和芯片之间形成类似“三明治”型免疫复合物，然后冲洗多余非靶向外泌体后即可进行SERS检测（图3）。我们发现越来越多的“拉曼探针-外泌体-芯片”这类SERS检测模型被提出并设计成相关试验。

2018年，Li等［43］开发了一种包被抗体的多巴胺芯片和SERS探针。该检测芯片及拉曼探针实现了对胰腺癌衍生外泌体的超灵敏和特异检测，可在2 mL样品溶液实现单个外泌体的检测，并且只需通过2 mL的血清样本的分析即可区分胰腺癌患者和健康人群。该方法有望用于胰腺癌的早期诊断、分类和转移监测等方面。同年，Kwizera等［44］将一个模板阵列固定在标准镀金玻璃镜片上，然后在阵列孔板上修饰抗体制备成一种小型化亲和基装置用于外泌体的捕获。金纳米棒通过十六烷基三甲基溴化铵与外泌体上的脂质膜之间的静电作用与外泌体相结合，可实现乳腺癌细胞培养基和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌患者来源的外泌体上几种表面蛋白标志物的定量检测。HER2阳性乳腺癌患者血浆中的外泌体比健康供体中的HER2和EpCAM的水平更显著（P≤0.01），表明HER2和EpCAM这些标志物在乳腺癌诊断中的诊断潜力。该试验将加速外泌体的研究，并为新型癌症液体活检的实现奠定基石。由于外泌体miRNA表达水平与癌症之间存在密切的关联，因此Lee等［45］开发了基于SERS的传感平台，用于定量测定外泌体miRNA。首先在均匀的金纳米柱基板上修饰捕获探针，当目标外泌体miRNA出现时就会被探针序列捕获，由于目标外泌体miRNA序列较长，还有部分序列裸露在外，因此再加入带有拉曼报道分子的序列与裸露的序列进行互补连接，即可在基底上同时锁定目标外泌体的miRNA及拉曼探针。该传感器可以可靠地观察乳腺癌细胞系中的外泌体miRNA表达模式，并可以基于这些模式之间的差异来区分乳腺癌亚型。结果表明，该传感器可定量测量体液中外泌体miRNA，有望用于普遍的癌症诊断和进一步的生物医学应用。

3 总结与展望

外泌体广泛存在于人体各种体液中，在细胞间信息传递系统中扮演重要角色，是一种新兴的液体活检标志物。然而当前有关外泌体的研究尚处于初级阶段，存在检测灵敏度低、检测步骤繁琐、成本费用高等问题。近年来，SERS技术被应用于外泌体的检测研究，极大地提高了外泌体检测的灵敏度，这对于基于外泌体的液体活检新技术的发展意义重大。SERS技术检测外泌体的形式主要分为非标记检测与标记检测。非标记检测可获得外泌体自身的整体生化信息，并且检测简便、快捷、成本低；而标记检测则提高了对外泌体识别的特异性，还能够同时识别并检测多种癌细胞系分泌外泌体。虽然目前SERS技术在外泌体检测方面已经取得一定的进展，但是深入研究依然面临许多挑战，例如：1）继续探索高效的SERS检测基底，进一步提高外泌体的拉曼信号，提升检测极限；2）继续发展适用于外泌体表面蛋白和内部核酸物质的SERS检测策略，获得高质量且重复性好的拉曼信号，提取全面的诊断信息；3）发展高效的机器学习算法，对外泌体的SERS信号进行深度挖掘，实现对不同来源外泌体的快速、准确识别；4）对外泌体进行功能化的改造，并结合SERS技术对外泌体的生物学行为进行表征；5）继续扩大临床检测样本，进一步验证基于SERS的外泌体检测技术的可行性和适用性。随着相关技术的进一步发展，我们相信基于SERS技术的外泌体检测技术有望成为一种无损、便捷、准确的液体活检新方法。