miR-184靶向ZNRF3调控口腔鳞状细胞癌增殖和转移的分子机制

辛欣 綦成 王昕

(1山东大学第二医院口腔科，山东 济南 250000；2济南市口腔医院牙周黏膜病科)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)具有侵袭能力强及恶性程度高等特点，由于OSCC患者极易发生淋巴结转移导致手术治疗效果差〔1〕。随着现代医疗水平的不断提高，可采用根治性手术辅助放化疗及靶向治疗等手段治疗OSCC，但由于OSCC发病机制尚未完全阐明导致治疗后患者生存率低及预后差〔2〕。因而探究OSCC细胞增殖及侵袭的生物学行为并寻找OSCC发生及发展相关的分子标志物可为靶向治疗提供新方向。微小RNA-184(miR-184)在口腔鳞癌细胞中高表达，抑制miR-184表达增加药物敏感性〔3～5〕。然而，miR-184表达变化对OSCC细胞增殖及转移的分子机制仍未可知。用靶基因预测网站预测出ZNRF3可能是miR-184的靶基因，研究表明ZNRF3在食管鳞癌细胞、胃癌中低表达，上调ZNRF3表达可促进癌细胞凋亡〔6〕。相关研究表明口腔鳞状细胞癌中ZNRF3低表达并可能起到抑癌作用〔7〕。然而miR-184是否可通过靶向调控ZNRF3表达进而影响OSCC细胞增殖、迁移及侵袭尚未有相关研究。本研究采用基因干扰技术沉默miR-184表达并分析miR-184表达变化对OSCC细胞增殖、迁移及侵袭的影响，验证其是否可通过调控靶基因ZNRF3而发挥作用并初步探究其可能作用机制，为OSCC治疗提供潜在靶标分子并可为基因治疗手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 舌鳞癌细胞CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；正常口腔黏膜细胞(Normol)购自美国Sciencell公司。杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM2000转染试剂盒及Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；miR-184 mimic、anti-miR-184、miR-184阴性对照序列及ZNRF3 siRNA序列均购自上海吉玛基因；β-actin、兔抗人ZNRF3一抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗均购自美国Cell Signaling公司；CDK4、细胞周期蛋白(Cyclin)D1单克隆抗体均购自美国Abcame公司；基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9抗体均购自美国CST公司；鼠抗人β-catenin、E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Vimentin单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；双荧光素酶报告系统购自美国Progema公司；基质胶购自上海前尘生物科技有限公司；细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、电化学发光(ECL)液等蛋白免疫印迹所需试剂均购自中国碧云天生物技术研究所；噻唑蓝(MTT)试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2细胞转染及分组 CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1及正常口腔黏膜细胞放入含有10% FBS的DMEM培养基在37℃、5%CO2、相对湿度95%的培养箱内培养。将SCC-9细胞分为4组，阴性对照组(anti-miR-con组)：转染阴性对照质粒；anti-miR-184组：转染miR-184抑制剂；anti-miR-184+si-con组：共同转染miR-184抑制剂与ZNRF3阴性对照质粒；anti-miR-184+si-ZNRF3组：共同转染miR-184抑制剂与ZNRF3 siRNA序列，严格按照转染试剂盒说明书进行操作，转染48 h后收集各组细胞进行后续实验研究。

1.3qRT-PCR检测细胞中miR-184及ZNRF3 mRNA表达水平 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度，根据检测结果配置反转录体系将RNA合成cDNA，参照qRT-PCR定量试剂盒说明书配置反应体系，包括cDNA模板2 μl/孔，SYBR Premix ExTaqⅡ12.5 μl/孔，miR-184与ZNRF3上下游引物各1 μl/孔，ddH2O 8.5 μl/孔补至25 μl。PCR扩增条件为1个循环(94℃ 5 min)与40个循环(94℃，30 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s)；72℃终延伸10 min。miR-184以U6 small nuclearRNA(U6)为内参基因，ZNRF3以β-actin为内参基因，miR-184与ZNRF3 mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.4Western印迹检测ZNRF3、CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9及β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达 收集细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，加入蛋白裂解液，经12 000 r/min离心15 min后吸取上清，测定蛋白浓度，各蛋白样品分别加入5倍上样缓冲液，5 min后吸取各样本30 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳实验(80 V 30 min，120 V 90 min)，反应完成后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下用脱脂奶粉封闭2 h，分别加入ZNRF3、CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9及β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤5次，5 min/次，室温条件下加入二抗孵育1 h，TBST洗涤5次，5 min/次，ECL化学发光试剂进行显色反应，置于凝胶成像系统分析各蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值为目的蛋白相对表达量。

1.5荧光素酶报告实验 利用在线数据库预测ZNRF3的3′UTR端存在miR-184的结合位点，克隆ZNRF3上与miR-184结合的序列，构建重组荧光素酶报告基因质粒pGL3-ZNRF3-3′UTR，改变ZNRF3中预测结合片段而建立pGL3-ZNRF3-3′UTR-mut突变荧光素酶报告基因载体，WT-ZNRF3与MUT-ZNRF3均经双酶切电泳反应鉴定，采用LipofectamineTM2000转染试剂分别将WT-ZNRF3、MUT-ZNRF3与miR-184 mimic共转染SCC-9细胞，转染48 h后按照荧光素酶检测试剂盒分别检测细胞相对荧光素酶活性。

1.6MTT检测细胞增殖 收集SCC-9细胞胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为5×104个细胞/ml，以每孔1×105个细胞接种于96孔板，用脂质体法分别或共同转染anti-miR-184、si-ZNRF3、anti-miR-con、si-con，转染方法及分组均参照“1.2”，分别在24、48、72 h加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液(20 μl/孔)，继续培养4 h，弃上清，每孔分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，应用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度(OD)值。实验设置3次重复。

1.7Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 预备：无血清DMEM培养基以1∶6稀释比稀释基质胶，4℃冰箱内孵育过夜，次日取100 μl稀释液置于Transwell小室上室；细胞处理：收集各组对数生长期SCC-9细胞，胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，调整细胞密度为2×105/ml，取200 μl细胞悬液置于铺满基质胶的Transwell小室的上室；观察与计数：室温孵育24 h后用棉签除去基质胶及Transwell小室的上室细胞，用预冷多聚甲醛固定20 min，结晶紫溶液染色5 min，在显微镜下随机选取5个视野计数。细胞迁移实验：除去“预备”实验步骤外，其余实验步骤均与细胞侵袭实验相同。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1舌鳞癌细胞中miR-184和ZNRF3的表达 qRT-PCR实验结果显示舌鳞癌细胞系CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1中miR-184表达水平相较于正常口腔黏膜细胞(Normol组)显著升高(P<0.05)，而ZNRF3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，同时Western印迹实验检测结果显示舌鳞癌细胞系CAL27、SCC-15 、SCC-9、UM1中ZNRF3蛋白表达显著低于Normol组(P<0.05)，见图1、表1。与CAL27、SCC-15、UM1细胞相比，SCC-9细胞中miR-184与ZNRF3表达均处于中等水平，因此选取SCC-9细胞进行后续实验。

2.2miR-184靶向调控ZNRF3的表达 应用靶基因预测网站检测出miR-184与ZNRF3之间可能存在碱基互补配对关系(图2)，通过构建野生型ZNRF3真核表达载体WT-ZNRF3与突变型ZNRF3真核表达载体MUT-ZNRF3，分别与miR-184 mimic共转染SCC-9细胞，双荧光素酶报告实验显示，共转染WT-ZNRF3与miR-184 mimic的SCC-9细胞荧光素酶活性呈显著性下降(P<0.05)，而共转染MUT-ZNRF3与miR-184 mimic的SCC-9细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，进一步采用Western印迹实验检测分别转染miR-184 mimic、anti-miR-184的SCC-9细胞中ZNRF3蛋白表达，结果显示转染anti-miR-184的SCC-9细胞中ZNRF3蛋白表达(0.55±0.03)高于miR-con组(0.25±0.04),差异有统计学意义(P<0.05)，而转染miR-184 mimic的SCC-9细胞中ZNRF3蛋白表达(0.11±0.06)低于anti-miR-con组(0.34±0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-184组WT-ZNRF3(0.62±0.07)显著低于miR-con组(1.00±0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)，而两组MUT-ZNRF3无明显变化，见图3。

图1 检测舌鳞癌细胞株中ZNRF3的表达

表1 舌鳞癌细胞株中miR-184和ZNRF3的表达

图2 miR-184靶向ZNRF3 3′UTR表达

图3 miR-184靶向调控ZNRF3蛋白的表达

2.3转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9增殖的影响 抑制miR-184表达后SCC-9细胞ZNRF3蛋白表达显著升高(P<0.05)，沉默ZNRF3后SCC-9细胞ZNRF3蛋白表达显著降低(P<0.05)。与anti-miR-con组比较，anti-miR-184组SCC-9细胞OD值(48、72 h)及CDK4、CyclinD1蛋白表达显著低于anti-miR-con组(P<0.05)，沉默ZNRF3后SCC-9细胞OD值(48、72 h)及CDK4、CyclinD1蛋白表达显著高于anti-miR-184+si-con组(P<0.05)，见图4、表2。

2.4转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9迁移和侵袭的影响 与anti-miR-con组比较，anti-miR-184组SCC-9细胞迁移及侵袭数均显著减少(P<0.05)，Western印迹检测显示anti-miR-184组SCC-9细胞MMP-3、MMP-9蛋白表达显著低于anti-miR-con组(P<0.05)。与anti-miR-184+si-con组比较，anti-miR-184+ si-ZNRF3组SCC-9细胞迁移及侵袭数显著增加(P<0.05)，而MMP-3、MMP-9蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，见表3，图5，图6。

1～4：anti-miR-con组、anti-miR-184组、anti-miR-184+si-con组、anti-miR-184+si-ZNRF3组；同图6，图7图4 转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9增殖蛋白的影响

表2 转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9增殖和细胞增殖蛋白表达的影响

表3 miR-184和ZNRF3表达对舌鳞癌细胞SCC-9迁移蛋白的影响

图5 transwell检测舌鳞癌细胞SCC-9迁移和侵袭(×200)

图6 Western印迹检测舌鳞癌细胞SCC-9转移相关蛋白表达

2.5转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9 EMT的影响 上皮-间质转化(EMT)与肿瘤细胞迁移及侵袭有关，通过在SCC-9细胞中转染anti-miR-184和沉默ZNRF3，观察其对SCC-9细胞EMT的影响，由图7、表4可知，anti-miR-184组SCC-9细胞上皮表型标志物β-catenin、E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05)，而间质表型标志物N-cadherin、Vimentin蛋白表达明显下降(P<0.05)。进一步研究显示，anti-miR-184+ si-ZNRF3组SCC-9细胞β-catenin、E-cadherin蛋白表达显著下调(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著上调(P<0.05)。

图7 β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达

表4 转染anti-miR-184和沉默ZNRF3对舌鳞癌细胞SCC-9 β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响

3 讨 论

OSCC属于头颈部常见恶性肿瘤之一，目前早期诊断及治疗OSCC成为重要难题〔8〕。miRNA在疾病诊断及治疗方面均具有一定应用价值，可通过降解靶基因表达进而调控多种肿瘤细胞增殖、凋亡等多种生物学过程〔9〕。研究表明miRNA异常表达可调控OSCC发生及发展过程，并可作为临床诊断及治疗的重要分子标志物〔10〕。以上研究结果表明miRNA在OSCC发生及发展过程中扮演重要角色，深入探究其对OSCC细胞增殖、迁移等恶性生物学行为的影响可为进一步揭示OSS发病机制奠定基础。

miR-184在骨肉瘤细胞中呈高表达，抑制miR-184表达可抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移，并诱导细胞凋亡〔11〕。Zhu等〔12〕研究表明，miR-184在鼻咽癌细胞中表达降低，通过上调miR-184表达后可直接靶向调控Notch2表达进而抑制鼻咽癌细胞迁移及侵袭。Wang等〔13〕研究表明前列腺癌细胞中miR-184呈低表达，而长链长非编码RNAMYU可通过竞争性结合miR-184而上调靶基因表达进而促进前列腺癌细胞增殖。Li等〔14〕研究表明miR-184在慢性粒细胞白血病细胞中呈高表达，长链长非编码RNAMEG3通过抑制miR-184表达进而抑制慢性粒细胞白血病中的细胞增殖和转移。由上述研究报道结果可推测不同肿瘤细胞中miR-184表达变化不同，然而关于miR-184在OSCC细胞中的表达及其可能作用机制研究相对较少，本研究结果提示miR-184可能在OSCC发生过程中发挥癌基因作用。采用基因干扰技术沉默miR-184表达，结果发现SCC-9细胞增殖活性明显降低，为阐明miR-184在SCC-9细胞增殖过程中的功能机制，本研究结果发现CyclinD1作为细胞周期重要调节因子，其可与CDK4结合形成复合物进而促使细胞周期由G1期进展转变为S期〔15〕。提示沉默miR-184可通过下调CDK4、CyclinD1蛋白表达进而抑制SCC-9细胞增殖，同时可诱导细胞周期停滞于G2/M期。进一步探讨miR-184与SCC-9细胞迁移及侵袭能力的关系，结果显示沉默miR-184显著降低SCC-9细胞迁移及侵袭能力。MMP-3、MMP-9属于MMPs家族成员，可通过降解细胞外基质而破坏细胞基底膜进而为肿瘤细胞迁移及侵袭提供有利条件〔16〕。提示沉默miR-184可能通过降低MMP-3、MMP-9蛋白表达而抑制SCC-9细胞迁移及侵袭。

ZNRF3在胃癌细胞中呈低表达，并可通过拮抗Wnt和Hedgehog信号通路诱导胃癌细胞凋亡〔17〕。ZNRF3在乳头状甲状腺癌中下调表达，并可抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭〔18〕。Wang等〔19〕研究表明ZNRF3可通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路进而抑制鼻咽癌细胞增殖及侵袭。然而，ZNRF3在OSCC细胞中表达变化及其可能作用机制研究相对较少，本研究结果显示舌鳞癌细胞CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1中ZNRF3均呈低表达，与上述研究报道中ZNRF3表达变化趋势相似，提示ZNRF3表达水平降低可能促进OSCC发生。通过双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-184的靶基因，为阐明miR-184是否通过调控ZNRF3表达而影响SCC-9细胞生物学行为，本研究结果说明沉默miR-184可通过上调ZNRF3表达进而抑制SCC-9细胞增殖、迁移及侵袭，其可能通过降低CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9蛋白表达而实现。EMT转化进程可促进OSCC细胞迁移及侵袭并可作为患者预后不良的重要影响因素〔20〕。β-catenin、E-cadherin等上皮表型标志物表达降低与N-cadherin、Vimentin等间质表型标志物表达升高可导致细胞骨架重构并减弱细胞间黏附力进而促进细胞迁移及侵袭，通过抑制EMT可抑制OSCC增殖及侵袭〔21，22〕。本研究结果说明沉默miR-184可通过调控ZNRF3进而上调β-catenin、E-cadherin蛋白表达及下调N-cadherin、Vimentin表达。提示miR-184可能通过调控靶基因ZNRF3影响OSCC细胞EMT转化进程进而促进细胞迁移及侵袭过程。