酸枣仁黄酮减轻全氟辛烷磺酸诱导小鼠肝脏氧化损伤

肖凤琴，张红印，韩荣欣，张荣榕，严铭铭*，张世阳，贾秀秀

(1.长春中医药大学 吉林省中药保健食品科技创新中心，吉林 长春 130117；2.上海纤连生物技术有限公司，上海 200120)

现研究表明酸枣仁成分复杂，含有皂苷类、黄酮类、多糖类、生物碱类、脂肪油类和蛋白类等化学成分。目前研究较为深入，报道较多的为酸枣仁皂苷类、黄酮类等化合物[1-2]。本课题组对酸枣仁各有效成分进行了研究，发现其黄酮类成分具有良好的抗氧化活性，因此本文以酸枣仁黄酮(Ziziphi Spinosae Semen Flavonoids，ZSSF)为研究对象通过观察其对正常小鼠和全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)诱导的氧化性肝损伤小鼠模型的体内氧化指标以及Nrf2/HO-1通路的影响[3]，以进一步评价ZSSF的抗氧化作用。ZSSF在抗氧化方面具有一定的研究潜力，为酸枣仁资源的进一步开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选用5周龄的雄性小鼠20只，雄性，体质量18～22 g[吉林大学实验动物中心，合格证号：SCXK(吉)2014-0003]。本研究的所有实验程序均符合长春中医药大学医学伦理委员会的伦理标准。

1.1.2 试剂：维生素C、PFOS、ZSSF由实验室自制(纯度51%,酸枣仁药材购买于吉林省仙草医药药材有限公司)；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、CAT、T-AOC试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Bradford蛋白质定量试剂盒和考马斯亮蓝溶液(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理[4-6]：灌胃给药的同时进行造模，除对照组外，其余各组按10 mg/kg剂量每日定时灌胃全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)溶液，连续给药30 d，建立PFOS诱导小鼠肝脏氧化损伤模型；将小鼠随机分为空白组、造模组、维生素C组(100 mg/kg)和ZSSF高、中、低剂量组(800、400和200 mg/kg)，每组10只[7-8]；空白组与模型组灌胃等量的蒸馏水，灌胃给药30 d。

1.2.2 血液及组织的制备：最后一次灌胃给药后，对所有组小鼠采取禁食不禁水的做法，6 h后对各组小鼠进行眼球取血，离心10 min(4 000 r/min)，离心结束后取上清液备用。小鼠脱颈处死后解剖小鼠，迅速取肝脏、胸腺、脾脏组织称重，肝脏加入9倍体积的0.9% 氯化钠溶液于匀浆器中制成10 % 的组织匀浆液，离心10 min(2 500 r/min)，取上清液备用。取上述处理好的上清液测定血清中的ALT、AST、MDA、SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的水平，按照试剂盒说明书进行测定。

1.2.3 RT-qPCR检测Nrf2、HO-1 mRNA在肝组织中的表达：采用液氮研磨将肝脏研磨成粉末，用Trizol试剂提取肝总RNA,将RNA反转录获得cDNA。采用RT-qPCR进行扩增(95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，59℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，40个循环)，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量[9-10]。引物序列为:HO-1上游引物5′-AAGAGGCT AAGACCGCCT-3′，下游引物5′-GCATAAATTCCCACT GCC-3′；Nrf2上游引物5′-GAGACGGCCATGACTGA T-3′，下游引物5′-GTGAGGGGATCGATGAGT-3′。

1.2.4 肝脏病理指标的检测：采血结束后，脱颈处死小鼠，迅速取出肝脏，用冰0.9% 氯化钠溶液冲洗后，滤纸吸干水分，在肝左叶中间部分切下厚度约0.5 cm的肝组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定后，进行常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明。将脱水后的组织进行石蜡包埋，片厚4 μm，采用HE染色，光镜下观察肝脏病理变化[11-14]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝功能的影响

与空白组相比，造模组小鼠血清的 AST、ALT水平极显著升高 (P<0.01)，给药干预后，各给药组与造模组相比，小鼠的ALT水平极显著降低(P<0.01)；ZSSF高剂量组与阳性对照组的AST显著降低(P<0.05)(表1)。

2.2 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝脏抗氧化水平的影响

与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏的MDA含量极显著升高 (P<0.01)，SOD、CAT、GSH-Px含量极显著降低(P<0.01)，T-AOC含量显著降低(P<0.05)；与造模组相比，给药干预后ZSSF高、中剂量组与阳性对照组(Vc)小鼠肝脏中的MDA含量极显著降低(P<0.01)，低剂量组显著降低(P<0.05)；各给药组与阳性对照组(Vc)小鼠肝脏中的SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC含量极显著升高或显著升高(P<0.01,P<0.05)(表2)。

表1 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝功能的影响

2.3 肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA的表达

模型组与对照组相比，肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA表达显著升高 (P<0.05)；与模型组相比，ZSSF各剂量组与阳性对照组(Vc)肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA表达极显著升高或显著升高(P<0.01,P<0.05)(表3)。

表2 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝脏抗氧化水平的影响

表3 肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA相对表达水平

2.4 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝组织形态学变化的影响

光镜下观察到空白对照组小鼠的肝细胞形态正常，未出现明显异常。模型组小鼠经过PFOS氧化性肝损伤后，光镜下观察到肝细胞出现脂肪泡发生脂肪变性、出现炎性反应。维生素C组小鼠的肝脏病理变化与造模组比较变化不明显。ZSSF各给药组肝脏病理变化与模型组相比相应减轻，发生空泡变性的细胞较少，肿胀程度较轻，肝细胞变性并且呈现剂量依赖性的范围缩小或程度减轻(图1)。

3 讨论

PFOS作为全氟化合物的代表物之一，其具有良好的表面活性和疏水疏油等特性。因此，从产以来就被广泛应用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革、洗发香波和灭火泡沫等工业和民用行业[15-16]。但是PFOS的毒性一直也是研究的热点，相关专家对其进行了系统性的毒性研究。研究结果表明，PFOS具有肝脏毒性对脂肪代谢具有一定的影响，可以导致大量的过氧化产物增加，在机体的多个脏器内发生氧化损伤，直接或间接地损害遗传物质[17-21]。因此本课题组选用PFOS作为肝脏损伤诱导剂。

最终实验结果表明，与空白组相比，造模组小鼠血清的AST、ALT水平极显著升高，说明模型组小鼠肝功能受到一定的损害，同时发现，模型组小鼠肝脏的MDA含量极显著升高，SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC含量显著降低，以上结果说明，本研究应用PFOS诱导小鼠肝脏氧化损伤的造模实验成功，最终得到氧化性肝损伤模型。

酸枣仁黄酮各剂量组与阳性组(Vc)小鼠肝脏中的MDA含量与模型组相比极显著或显著降低，SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC含量与模型组相比极显著或显著升高，实验结果表明酸枣仁黄酮在体内具有良好的抗氧化作用。Nrf2在体内作为抗氧化的重要转录因子，参与机体的氧化应激反应。当发生氧化应激反应时，Nrf2相应的被激活与抗氧化反应元件相结合且启动 HO-1基因的转录，实现抗氧化作用[22-23]。本实验中，酸枣仁黄酮各剂量组较模型组小鼠肝组织中Nrf2和HO-1蛋白表达明显增加，提示酸枣仁黄酮抗氧化作用与调节 Nrf2/HO-1途径相关。

A.normal control; B.model group; C.positive control group; D.high dose group; E.middle dose group; F.low dose group图1 酸枣仁黄酮对PFOS氧化性肝损伤小鼠模型肝组织形态的影响Fig 1 Effect of Ziziphi Spinosae Semen Flavonoids on the morphology of liver tissue in PFOS mice model(HE,×200)