非小细胞肺癌患者血浆外泌体APE1的表达与铂类化疗敏感性相关

赵晓龙，代晓燕，毛成毅，肖华亮，王 东，戴 楠*

(陆军军医大学大坪医院 1.肿瘤科； 2.病理科，重庆 400042)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%[1]。在中国，由于早期肺癌临床症状不明显，肺癌筛查未全面普及，大部分患者发现时已为中晚期[2]。含铂化疗是无驱动基因突变的NSCLC患者的标准治疗，然而有相当一部分患者对铂类治疗不敏感，出现耐药后迅速进展，这严重影响患者的疗效和生存[3]。

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(apurinic aprimidinic endonuclease 1, APE1)与非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)的发生、发展和预后密切相关[4]。研究发现，APE1 蛋白及自身抗体存在于NSCLC 患者外周血中，NSCLC 患者血清 APE1蛋白和抗体水平明显高于健康体检者[5]。问题是缺乏分泌信号肽的典型核蛋白APE1是通过什么方式进入血液的呢？外泌体是直径在30～150 nm的小囊泡，能够包裹核酸、蛋白和脂质等生物活性物质[6]。据此推测，APE1可能存在于外泌体中，并通过外泌体分泌到血液中。为验证这种假设，本研究提取了无驱动基因突变的晚期NSCLC患者血浆外泌体，首次发现APE1存在于血浆外泌体中。对NSCLC患者铂类化疗前后的血浆外泌体APE1进行动态监测，发现血浆外泌体APE1与铂类化疗敏感性密切相关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究人群：选取2017年1月至2018年1月保存于大坪医院临床生物样本库的晚期NSCLC患者72例，48例体检的正常人作为对照，用于研究NSCLC患者与正常人血浆外泌体APE1水平的比较；其中31例有对应的穿刺组织标本，用于检测组织APE1水平与血浆外泌体APE1水平的关系。收集2018年1月至2019年6月就诊大坪医院肿瘤科的晚期NSCLC患者64例，用于研究外泌体APE1与铂类治疗敏感性的关系；其中24例有化疗前后血浆样本，用于研究化疗前后APE1水平变化。根据RECIST 1.1版评价标准，将患者分为化疗应答组(CR+PR，n=22)和无应答组(SD+PD，n=42)。所有患者均明确诊断为ⅢB或Ⅳ期无驱动基因突变的NSCLC，并接受含铂双药一线化疗，未联合抗血管生成治疗。本研究经大坪医院伦理审查委员会批准(伦理审批编号：2018-113)，所有患者均签署知情同意书(表1)。

表1 研究对象基本资料

1.1.2 试剂： Total Exosome Isolation Kit(Invitrogen公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)；抗APE1抗体(Novus Biological公司)，抗CD9、CD63、β-tubulin 抗体(Abcam公司)，人APEX1酶联免疫试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血浆外泌体的分离和鉴定：采用EDTA采血管收集静脉血5.0 mL，静置30 min，2 000 r/min离心10 min，取上层血浆，10 000×g离心20 min，取上清后采用血浆外泌体提取试剂盒，按说明书步骤提取血浆外泌体。

1.2.2 电镜(transmission electron microscope，TEM)观察外泌体及纳米示踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)：取外泌体样本 5 μL 滴加在铜网上，室温孵育 5 min，滴加2%的乙酸双氧铀，室温干燥20 min，采用透射电镜观察外泌体形态。取10 μL外泌体样本进行相应比例稀释，利用纳米粒度颗粒跟踪分析仪进行纳米示踪分析。

1.2.3 Western blot检测蛋白：配制SDS-PAGE胶，取10 μL外泌体蛋白进行电泳，100 V恒压条件下转膜90 min，在5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入一抗稀释液(APE1 1∶1 000，CD9 1∶1 000，CD63 1∶1 000，β-tubulin 1∶2 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后加入相应种属二抗(1∶5 000), 37 ℃ 孵育1 h，TBST洗涤，采用化学发光显影系统显影。

1.2.4 ELISA检测APE1蛋白：提取200 μL血浆中的外泌体，根据实验需要，将外泌体加入含或不含1% Triton X-100 的PBS溶液中充分混匀后，采用人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APEX1)酶联免疫试剂盒，按说明书操作，对外泌体APE1进行定量检测。

1.2.5 免疫组化(IHC)检测APE1蛋白：取石蜡标本进行切片、脱蜡和水化后置于含pH 9.0 EDTA溶液高压锅中加热修复。流水冲洗后，用30% H2O2-methanol溶液浸泡封闭10 min。PBS冲洗3次后滴加APE1一抗，置于湿盒中，4 ℃过夜。PBS清洗3次，擦干后滴加二抗，37 ℃孵育25 min后，PBS清洗3次，滴加DAB显色，冲洗后用苏木精复染，脱水封片、评分并拍照。评分方法：根据细胞染色深浅及阳性细胞比例将APE1表达水平分为0,1,2,3，共4个等级，将评分0,1定义为低表达，评分2,3定义为高表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血浆外泌体的提取与鉴定

血浆外泌体呈现椭圆形的双层膜结构，外泌体的粒径大小整体合乎标准(30～150 nm) (图1A,B)。 Western blot检测发现有外泌体特异性标志物CD63和CD9的存在 (图1C)。

2.2 外泌体中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式

血浆外泌体中存在APE1蛋白(图2A)。ELISA检测结果显示，NSCLC患者外泌体中的APE1水平明显高于未用Triton X-100处理过的样本(P<0.0001)(图2B)，提示APE1主要被包裹于外泌体的脂质膜结构内。

2.3 非小细胞肺癌患者外泌体APE1高表达

ELISA检测发现，NSCLC患者外泌体APE1水平为(658±251)pg/mL，明显高于正常人的(182±96)pg/mL(P<0.0001)(图3)。

A.TEM(80 kV)；B.NTA；C.Western blot图1 NSCLC患者血浆外泌体的鉴定Fig 1 Identification of plasma exosomes in NSCLC patients

A.Western blot；B.APE1 level in exosomes；*P<0.000 1 compared with PBS group图2 血浆外泌体APE1的表达情况Fig 2 Expression of APE1 in

2.4 非小细胞肺癌组织APE1水平与血浆外泌体APE1水平成正比

肿瘤组织免疫组化染色情况图4A，评分为0或1分(低表达)患者为15例，评分2或3分(高表达)为16例。组织高表达APE1的患者，其血浆外泌体APE1水平较组织APE1低表达患者明显升高(P<0.01)(图4B)。

*P< 0.0001 compared with the control group图3 NSCLC患者与正常人血浆外泌体APE1的表达Fig 3 Expression of APE1 in NSCLC

2.5 外泌体APE1水平与铂类治疗敏感性相关

与化疗应答组相比，无应答组的外泌体APE1水平明显升高 (P<0.001)(图5A)。对比化疗前后APE1水平的改变，无应答组的外泌体APE1在化疗后明显增高(P<0.01)(图5B)，而应答组APE1则无明显变化(图5C)。

3 讨论

铂类一直是晚期无驱动基因突变NSCLC患者的基础治疗药物。然而有研究表明，以铂类为基础的化疗方案有效率仅为30%～40%[7]，耐药严重制约了铂类在NSCLC中的应用。铂类主要通过与DNA结合形成加合物[8]来对肿瘤细胞造成杀伤。研究发现APE1在 DNA损伤修复过程中发挥关键作用[9]，APE1可能在一定程度上影响铂类治疗的疗效，肿瘤组织高表达APE1的患者中有高达83.3%的患者对顺铂化疗耐药[10]。然而，目前大部分的研究仅局限于肿瘤组织，因此研究血液中的外泌体APE1，可以拓展其临床应用价值。

A.IHC；B.APE1 level in plasma exosomes；*P<0.01 compared with low t-APE1 group图4 肿瘤组织低表达与高表达APE1患者的血浆外泌体APE1表达情况

A.exosome APE1 level of responding **P<0.001 compared with responding group; B.exosome APE1 level during chemotherapy in non-responding patients *P<0.01 compared with pre-chemotherapy level; C.exosome APE1 level during chemotherapy in responding

外泌体是直径在30～150 nm脂质膜囊泡，内含核酸、脂质、蛋白质等生物活性物质[6]。本研究通过免疫学方法发现APE1确实存在于血浆外泌体中。在检测过程中，如使用非离子型去垢剂Triton处理外泌体，APE1的检出浓度将迅速提高。究其原因，极有可能是由于外泌体脂质膜结构被破坏，导致其中包裹的APE1更容易被检出。实际上，血液样本中APE1的检出浓度很低[11]，因此检测血浆外泌体APE1的表达水平，可以极大的提高检测灵敏度，提高其在临床上的应用价值。

本研究发现，NSCLC患者血浆外泌体APE1的表达与组织APE1表达水平成正比，这提示外泌体APE1也可作为判断NSCLC疗效的指标。进一步研究发现，铂类化疗疗效不佳的患者中，外泌体APE1的表达明显升高；同时，化疗后外泌体APE1升高的患者，其疗效比外泌体APE1无明显变化(甚至降低)的患者更差。其机制可能为该部分患者，除自身肿瘤组织APE1表达增高外，APE1还会以外泌体的形式释放，并通过外泌体来传递耐药性。这也说明血浆外泌体APE1同样能作为铂类化疗疗效的指标，且更有意义：血液检测属无创操作，可用于动态监测评估疗效和调整用药方案，更好的服务于临床实际。

综上所述，APE1在NSCLC患者血浆外泌体中高表达，其表达高低与患者铂类治疗疗效有关。然而，为了更加全面的对NSCLC外泌体APE1进行研究，未来还需要对APE1进入外泌体中的机制以及非癌性肺部病变患者血浆的外泌体APE1表达情况进行探索；此外，由于APE1是具有DNA损伤修复功能和氧化还原调控功能的双功能基因，可通过多种途径导致化疗耐药[12]，因此外泌体APE1导致铂类耐药的机制也有待一步研究。