人羊膜上皮细胞改善器官纤维化的研究进展*

刘 敏 综述，张臣臣，何希彪，尹熙惠，方成虎△ 审校

(1.延边大学附属医院心血管内科，吉林 延吉 133000；2.上海健康医学院基础医学院，上海 201318；3.延边大学附属医院儿科，吉林 延吉 133000)

人体组织器官在不利因素下发生损伤时，会激发自身保护机制，启动胶原纤维修复、填充受损部位,使结构及功能初步恢复[1]。病理状态下或有害刺激持续存在时，炎症、组织重塑和修复过程将不受机体稳态调控，引发细胞外基质(ECM)生成和降解失衡，最终演变为难以调控的、以纤维组织增生为主的过程，即器官纤维化[2]。心、肺、肝等重要器官发生纤维化时若未得到及时有效的治疗，将造成器官硬化或器官衰竭，危害人类生理、心理健康，甚至危及生命。目前，器官移植是器官纤维化终末阶段成效最显著的临床方案，但由于供体稀缺、存活率低、费用高昂、移植后发生排斥及感染风险高等问题[3]，并不能使大多数患者受益，故亟须寻找其他疗效更显著、应用更安全、操作更简单的治疗方案。近年来，研究发现，将具有干细胞特性的细胞移植到纤维化的器官中，可以修复因过度纤维组织增生破坏的器官结构和功能。人羊膜上皮细胞(hAECs)具有可塑性、多能干细胞特性、非致瘤性、低免疫原性等优点，解决了传统干细胞移植带来的安全及伦理难题，成为当前细胞替代治疗器官纤维化的研究热点。

1 hAECs的来源及特性

羊膜由上皮层、基底层和间质层组建，是位于胎盘胎膜最内层，厚度0.02～0.50 mm的半透明膜[4]。囊胚在胚胎发育5～6 d嵌入子宫并分化为上、下胚层，约第8天在上胚层近滋养层侧出现羊膜腔，hAECs单层排列于腔侧背面的上皮层，故hAECs由多能性上胚层分化而来[5]。由于hAECs发生先于原肠胚，即器官分化前，而且羊膜腔阻碍了器官形成信号作用于hAECs，故推测其存留较多干细胞特质，具有可塑性[6]。足月剖宫产后的遗弃胎盘是hAECs理想的细胞源泉，2005年MIKI等[7]运用酶消化法和差异黏附法分离hAECs进行培养，并鉴定细胞表面标志物及相关基因，发现hAECs存有维持干细胞分化能力的关键基因及胚胎干细胞标志物，如OCT-4、NANOG、SOX-2、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81，证明了hAECs的胚胎干细胞特性。实验进一步对hAECs的可塑性进行了探究，证实了hAECs具有向不同胚层细胞分化的能力，可以分化为肝细胞、心肌细胞、肺泡上皮细胞、神经细胞等。

更重要的是，hAECs不表达端粒酶基因，其DNA染色体末端因失去端粒酶保护发生短缩，使DNA复制过程中断，细胞增殖受阻，具有非致瘤性[8]。YANG等[9]采用无血清hAECs分离和培养方法，分别在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内静脉注射低或高剂量hAECs，并载入B16-F10细胞(促进肿瘤发生)后，对致瘤性问题进行连续4个月的观察，结果示无论低或高剂量hAECs注射，均未导致肿瘤发生。

胎儿在母体内孕育而未发生免疫排斥反应，很大程度上与羊膜参与构成的免疫屏障有关。李娟[10]研究表明，羊膜具有低免疫原性，其对34例角膜溃疡患者实施羊膜移植手术，术后均未发生明显的排斥反应。SAKURAGAWA等[11]发现，hAECs在使用诱发细胞表面抗原表达的γ-干扰素处理3 d后，未出现任何类型的表面抗原表达增加。INSAUSTI等[12]发现，hAECs能够持续性表达非经典的人白细胞抗原-G(HLA-G)，该抗原通常表达于免疫赦免器官，如睾丸、卵巢、胚胎细胞。由此可见，hAECs具备安全、可靠移植的免疫学特性，即低免疫原性。

此外,hAECs还具有旁分泌功能，分泌多种类型的生长因子、趋化因子、血管紧张素(ANG)、白细胞介素(IL)及纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)，参与人体免疫调节、抗炎、抗纤维化及细胞增殖、迁移和凋亡等过程[13]，可能在抗器官纤维化过程中发挥关键作用。

2 hAECs抗器官纤维化的临床前研究

2.1心肌纤维化(MF) MF是缺血缺氧、代谢紊乱、微生物、毒物等危险要素侵害心肌细胞引起的胶原网络重构[14]。MF常见于高血压、心肌梗死(MI)发生后，纤维组织增生，心肌和血管壁结构重塑，造成心室弹性及顺应性降低、兴奋-收缩耦联异常、心脏射血及充盈受限，引发恶性心律失常和心力衰竭，增加心源性猝死的风险[15-16]。目前，以血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)为代表的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)抑制剂，以及钙通道阻滞剂、β-受体拮抗剂、他汀类药物，虽然能通过治疗引起(或促进)纤维化的潜在心血管疾病，改善心室重塑，但并不能逆转MF本身[15]。近年来，hAECs在心血管疾病方面的研究中取得较多进展，为治疗MF带来希望。

早在2005年，MIKI等[7]就提出hAECs具有胚胎干细胞特性，可以在体外诱导条件下向中胚层的心肌细胞分化。随后，张路等[17]在添加了5-氮杂胞苷和抗坏血酸盐的培养基中，对hAECs进行体外诱导12 d，分化后的细胞用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到心脏发育相关的转录因子Nkx-2.5、GATA-4，而未检测到心肌特异性可收缩蛋白基因MHC，说明在体外诱导条件下hAECs可以分化为心肌样细胞，但这些细胞尚不具备成熟心肌细胞的收缩功能。2012年，临床首次对hAECs在体内分化为心肌样细胞进行报道。FANG等[18]利用液氮对大鼠左心室进行冷冻损伤，模拟MI发生，用CM-DiI标记hAECs并注射到梗死区，4周后在坏死区域及周围通过荧光显微镜追踪到CM-DiI和MHC共表达的细胞，这些细胞经过免疫印迹分析、RT-PCR技术，检测到心脏特异性标志物MHC、α-SMA、肌钙蛋白Ⅰ及Nkx-2.5、GATA-4的表达，且数量均高于生理盐水组，说明hAECs在体内向心肌样细胞分化，且表达与心肌细胞收缩功能相关的蛋白。同时正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)结果示梗死面积减少，超声心动图示左室扩张减轻、射血分数提高，提示受损心脏功能得到改善。重要的是，该实验发现hAECs可改善MI的获益情况，能与脐带血和脂肪源间充质干细胞组相媲美。由此可见，hAECs移植后能够缩小MI引起的纤维化面积、改善心室重塑、提高心功能，是细胞替代治疗MF的理想细胞资源。

hAECs分化后的心肌样细胞，虽然具有心肌细胞的结构和功能，但是移植后在受损组织微环境中存活率极低，仅检测到3%[18]，故推测hAECs取得移植治疗成效的关键并不是依靠其可塑性。SONG等[19]认为，相比数量较少的心肌样细胞，hAECs旁分泌产生的细胞因子可能在修复受损心肌过程中的作用更显著。该团队虽然在MI模型的坏死区及周围，检测到大量能够刺激血管新生和内皮细胞增殖的细胞因子，但是并不能确定是哪些因子起到治疗纤维化的作用。值得注意的是，hAECs产生的细胞因子在移植1周后表达明显下降。因此，如何优化hAECs的旁分泌特性及提高细胞因子的持续时间，将是下一步研究的重点问题。

2.2肺纤维化(PF) PF是肺血管内皮或肺泡上皮细胞反复损伤导致进行性炎性反应、肺组织弥漫性重构及不可逆瘢痕形成的结果，可以造成肺组织硬化，弹性及顺应性下降，肺泡获氧能力下降，甚至是呼吸衰竭[20]。吡非尼酮、尼达尼布等药物治疗只能减轻症状，不能延缓PF的发展，也无法提高生存率，致使许多患者仍会进展到终末期[3]。

博来霉素(BLM)是临床上常用的抗肿瘤药物，用药后增加体内促纤维化因子的表达，造成肺组织内ECM蛋白沉积，诱发肺部炎症及纤维化，导致肺损伤和肺功能下降。MOODLEY等[21]利用鼻内给予BLM，诱导SCID小鼠发生PF，构建肺损伤模型，将小气道生长培养基中的hAECs经尾静脉植入模型鼠体内，检测到大量NKx2.1和SPs在肺损伤处聚集。已知NKx2.1是肺发育早期标志物，参与肺分支、Ⅱ型肺泡上皮细胞形成；SPs是表面活性蛋白，能够有利于降低肺泡表面张力。此外，超微结构检查显示，分化后的细胞含有典型的Ⅱ型肺泡上皮细胞板层体。这些结果表明，经静脉移植的hAECs可以归巢到肺组织并分化为Ⅱ型肺泡上皮样细胞。实验进一步发现，小鼠经BLM处理后IL-1、IL-2、IL-6、肿瘤生长因子(TGF)-β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2及胶原蛋白表达增加，但在hAECs注射后这些指标均有明显降低，肺损伤和PF得到改善。因此，注射hAECs能够减轻肺部炎症及纤维化，改善肺泡获氧能力。

HE等[22]通过荟萃PubMed和EMBASE关于“hAECs移植治疗BLM所致PF”的临床前研究，提出hAECs减轻PF可能是细胞归巢、细胞分化及免疫调节作用的结果。具有肺上皮表型的hAECs通过归巢至受损部位和转分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞，引起内源性肺组织再生，使TGF-β等促纤维化因子减少，纤维化面积缩小。另一方面，hAECs通过旁分泌机制改变宿主的免疫微环境，引起免疫调节作用，使促炎、促纤维化因子表达减少，改善PF的治疗效果。

2.3肝纤维化(HF) HF是由酗酒、病毒感染、毒性物质或代谢产物沉积等原因引起的慢性肝损伤，也是多种肝脏疾病共同的终末期结局[23]。再生能力较强的肝组织在反复损伤的状态下，自我修复能力被削弱，引起ECM蛋白沉积，假小叶形成，导致肝功能减退和门静脉高压症等肝硬化表现，最终演变为肝癌、肝衰竭[24]。肝星状细胞(HSC)和Kupffer细胞对启动和推进HF至关重要。HSC能够活化肌成纤维细胞，分泌ECM蛋白和促纤维化因子，加速纤维组织增殖；肝Kupffer细胞和单核细胞具有介导免疫损伤和吞噬清除能力，在慢性肝损伤期间持续向M2型极化，促使纤维化持续发展[25]。因此，调节HSC数量和巨噬细胞表型可能限制HF的发展。尽管如此，对于许多发展为肝硬化终末期的患者而言，除了肝移植外，尚缺乏有效的治疗方法。虽然这类手术已经非常成熟，但是手术难度系数高、供体数量少、移植后反应多等问题限制了其临床应用。过去10年的临床前研究结果显示，hAECs用于治疗肝脏疾病具有潜力和优势，有望代替器官移植成为终末期肝病患者的更优选择[26]。

经证实，hAECs在体内外均可分化为多种类型的肝组织细胞[27]，包含肝细胞、HSC、胆管细胞及肝窦内皮细胞等，分化后细胞表达清蛋白、谷氨酰胺合成酶及细胞色素酶等基因，并表现出合成与分泌清蛋白、储存糖原、促进物质代谢等成熟肝细胞的功能。此外，对四氯化碳诱导的HF模型进行研究，将hAECs经脾注射后，免疫组织化学显示纤维结节及条索状改变明显减少，TGF-β1表达水平下降，血清谷氨酰胺合成酶降低，清蛋白增多，证明hAECs具有抑制纤维组织生成、减少肝内纤维化面积、改善肝功能的治疗作用[28]。

KUK等[29]向非酒精性脂肪肝模型体内注射hAECs的条件培养基，结果显示，HF面积、HSC及巨噬细胞数量均减少，衰减的肝功能得到改善。hAECs的条件培养基与hAECs具有相似的治疗效果，说明其中必然存在某些物质能改善脏器功能、减轻纤维化，而这些物质很可能是hAECs旁分泌产生的。这预示更经济、更简单、更安全的无细胞治疗将成为热门研究领域。此外，具体是何种物质、以何种途径参与器官纤维化的治疗，仍需要进一步研究。

3 hAECs抗器官纤维化的临床研究

近年来,hAECs治疗器官纤维化的研究已经进展到临床试验阶段。第1次临床实验在6例支气管发育不良的早产儿身上进行，目的是观察hAECs移植后的安全性和有效性。在2018年的报告中显示，接受静脉注射hAECs的6例患儿，仅1例在细胞移植过程中发生了急性心肺不良反应，改变细胞移植方法后，其余受试者均未见急性反应事件[30]。在后来2年的随访期间，患儿没有发生与细胞移植相关的不良后果，呼吸功能也得到了改善[31]。由此可见，hAECs移植治疗十分安全,且具有一定程度的治疗效果。近期，24例支气管发育不良的早产儿接受了新的多中心剂量递增试验，正在进行安全性评估和细胞因子检测，结果预计在2022年公布[32]。目前，LIM等[33]正在进行第一阶段的试点研究，12例肝硬化代偿期的患者经静脉注射同种异体hAECs，之后对患者的标准肝脏检查、瞬时弹性成像和肝脏超声结果进行长期随访，评估静脉注射hAECs的安全性和耐受性。这是首次在成人应用hAECs治疗HF的试验，尽管随访结果尚未统计，但必将为2期和3期临床试验开辟道路。以上研究，预示着hAECs将在未来数年取得更大进展，并成功用于临床治疗。

4 hAECs移植治疗的新策略

尽管细胞替代治疗在抗器官纤维化方面应用前景广阔，但是干细胞移植的存活率很低，严重限制其临床应用。hAECs经循环进入体内，将归巢至肺和肝，极少迁移到心脏，移植效率非常差[6]。心肌内注射hAECs可提高其存活率，却也只有3%[18]，可见hAECs等干细胞移植后很难存活，寻找提高存活率的方法尤为重要。据报道，对干细胞进行缺氧缺血模拟、细胞微型包囊技术、基因改造及组织工程等移植前处理，可提高移植后存活率[34]。例如，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化及抗细胞凋亡作用的抗衰老基因，转染至干细胞后，能显著提高移植细胞的存活率及治疗效果。向心力衰竭模型大鼠体内，注射转染了重组慢病毒介导的抗衰老基因(klotho基因)的骨髓间充质干细胞，可使细胞的存活率及旁分泌特性升高，进一步提升其对MF的治疗效果[35]。因此，klotho基因转染hAECs可能成为未来hAECs抗器官纤维化的新方案。

hAECs的旁分泌作用是移植治疗器官纤维化的主要机制之一。外泌体(Exo)是hAECs分泌形成的胞外囊泡，同样具有促进成纤维细胞增殖、血管重建、抑制瘢痕形成等修复作用，成为细胞移植的新途径[36]。其中，TAN等[37]用BLM构建肺损伤模型，发现hAECs-Exo能增强巨噬细胞的吞噬能力，抑制T细胞增殖，发挥减少肺部炎症、纤维化及促进内源性肺修复的作用。此外，hAECs-Exo已经证实能够减轻肝脏疾病的严重程度[23]。目前，虽然缺乏hAECs-Exo对心脏疾病的研究，但是多种干细胞Exo已表现出对心脏的保护作用[38]，提示hAECs-Exo有治疗心脏疾病的潜力，是抗器官纤维化的新策略。

5 小 结

器官纤维化是各种器官和组织受到持续性损伤刺激后，炎症、组织重塑和修复过程在受损部位反复发生的最终结果。当前的治疗措施存在许多弊端和隐患，寻找安全有效的治疗方案意义深远。羊膜作为妊娠后废弃物，来源广泛，取材便利，符合伦理，已经成功用于治疗眼病、皮肤病等临床患者。hAECs位于羊膜上皮层，其可塑性、非致瘤性、低免疫原性及旁分泌特性用于细胞移植更具优势。近年来，已经开展的大量关于hAECs临床前研究，证明了hAECs抗器官纤维化的作用，而相关后续临床研究也正在开展。

hAECs通过细胞归巢、细胞分化及旁分泌机制，达到治疗器官纤维化的作用。值得注意的是，hAECs分化而来的细胞在改善器官纤维化过程中并非占据核心地位，而hAECs旁分泌引起的免疫调节作用可能是至关重要的。hAECs通过改变内环境中部分细胞因子的表达，进而减弱肌成纤维细胞的激活，抑制单核细胞/巨噬细胞的募集，促进巨噬细胞向修复表型的极化，诱导调节性T细胞分化及调节MMPs/TIMPs等，抑制ECM蛋白沉积，逆转纤维化。另外，hAECs的条件培养基和Exo等衍生产物也具有减轻纤维化的效应，成为细胞替代治疗新的途径。klotho基因转染hAECs是提高移植细胞存活率、增强治疗效果的新思路。

目前，hAECs治疗器官纤维化的研究大多在细胞水平和动物模型中展开,由于缺乏对人体复杂的免疫系统及内环境的完全模拟，若想将hAECs疗法应用于临床仍需考虑许多问题。例如，hAECs植入人体后能否存活，是否可以发挥生物学效应；存活率低，如何优化储存及提高存活时间；体外传代过程中如何高效扩增并维持细胞特性；细胞移植时的方式、途径、时机、数量如何选择；如何有效优化hAECs的特性或提取hAECs的关键分泌物等。虽然，hAECs的临床应用存在许多尚未解决的难题，但相信未来临床会陆续攻克这些问题，并成功将hAECs应用于临床治疗。