柱前衍生化-高效液相色谱法分析缅甸刺梧桐胶多糖的单糖组成

付兴情， 黄 绿， 吴 增， 王瑞丽，冯家泽， 顾 雯， 赵荣华*

(1.云南中医药大学中药学院，云南昆明 650106；2.南药研究协同创新中心，云南昆明 650500；3.云南省高校民族药现代研究重点实验室中药炮制研究开发中心实验室，云南昆明 650500；4.云南经济管理学院，云南昆明 650106)

刺梧桐胶(Karayagum,Sterculiagum,Snow Petrel)是来源于梧桐科(Sterculiaceae)苹婆属(Sterculia)高大的刺苹婆树，以及其他苹婆属树种的树干分泌物[1]，同时在胭脂树科(Bixacene)的CochlospermumgessypiumA.PDe及其他Cochlospemum属的树干中也可以提取到刺梧桐胶[2,3]。刺梧桐胶主要分布于苏丹、印度、巴基斯坦和缅甸，我国云南也有大量采胶树种分布。刺梧桐胶属于部分乙酰化的弱多糖，具有复杂的多支链结构，相对分子质量高达900万以上，经水解产生43%D -半乳糖醛酸、14%D -半乳糖、15%鼠李糖以及少量的葡萄糖醛酸[4,5]。

在植物多糖研究中，单糖的组成是最基本、最基础和最关键性的环节[6]，特征的单糖组成和单糖摩尔比，可用于结构鉴定和质量控制[7,8]。常用的分离技术有毛细管电泳(CE)[9]、气相色谱(GC)[10]和高效液相色谱(HPLC)技术[11,12]。其中,HPLC法稳定性好，色谱柱类型较多，技术相对成熟，所以越来越多的单糖分离分析使用HPLC技术[13]。糖类物质无紫外(UV)吸收基团，无法用HPLC-UV法直接进行分析，但1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)可以在温和条件下与糖链进行反应，使糖类物质带上发色基团，从而能被检测，与柱前衍生化-气相色谱法相比更为便捷[14-17]。本研究以缅甸刺梧桐胶样品为试材(市面上以商品名“雪燕”进行销售)，通过超声碱提法提取刺梧桐胶多糖，经三氟乙酸催化水解和PMP衍生化后，再经HPLC法分析，可以分析缅甸刺梧桐胶多糖中单糖组成，并为后续刺梧桐胶质量控制研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国，安捷伦科技有限公司)；ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美国，Phenomenex公司)；AB265-S电子分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；FD5-3P真空冷冻干燥机(北京博医康科技有限公司)；RV8旋转蒸发仪(德国，IKA公司)；SK7210HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SAGA-10TF超纯水机(南京易普易达科技发展有限公司)。

1.2 试剂与材料

对照品：葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、岩藻糖(Fuc)(均为分析纯)购于北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)(均为分析纯)购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)购于美国Sigma公司；石油醚、三氯甲烷、正丁醇(均为分析纯)购于汕滇药业有限公司；NaOH、NH4Ac(均为分析纯)购于西陇科学股份有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(均为分析纯)购于上海麦克林生化科技有限公司；乙醇(95%)购于昆明滢澈试剂有限公司。实验用水为纯净水和超纯水。

实验所用刺梧桐胶购自缅甸曼德勒，经云南中医药大学赵荣华教授鉴定为梧桐科苹婆属植物刺苹婆(SterculiaurensRoxb.)树干分泌物。

1.3 实验方法

1.3.1 刺梧桐胶多糖的提取称取适量刺梧桐胶粉末，加3倍量石油醚回流1 h(脱脂)，抽滤，取滤渣；滤渣中加入3倍量80%乙醇回流1 h，抽滤，取滤渣；加入100倍体积的0.06 mol/L的NaOH溶液超声提取1.5 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液。用稀HCl中和至pH为7，浓缩，用Sevag法[18,19]脱蛋白后，加入95%乙醇至醇浓度达80%，置于4 ℃过夜，取沉淀用无水乙醇淋洗，真空冷冻干燥，即得刺梧桐胶粗多糖。将7个不同等级的刺梧桐胶按上述方法提取，即得7份自制刺梧桐胶多糖。

1.3.2 多糖的水解[20]精密称取刺梧桐胶多糖50 mg于安瓿瓶中，加1 mL 2 mol/L的三氟乙酸，封管，于110 ℃水解4 h，取出后冷却至室温，用2 mol/L的NaOH溶液中和至pH为7，高速10 000 r/min离心10 min，取上清液定容至5 mL，即得多糖水解液。

1.3.3 刺梧桐胶多糖PMP衍生化[20]精密吸取0.4 mL多糖水解液，置于10 mL玻璃管中，依次加入0.8 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，0.8 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混匀，置于70 ℃水浴中反应60 min，取出冷却至室温，加入0.8 mL 0.3 mol/L HCl中和，混匀，加入等量的氯仿涡旋2 min，静置5 min，弃去下层有机相，如此萃取5次，上清液过0.45 μm水性微孔滤膜，即得衍生物溶液。

1.3.4 单糖混合对照品制备及衍生化分别精密称取4 mg各对照品，用超纯水定容至2 mL(Rha、Ara、Glc、Xyl、Man、Gal、GlcUA、Fuc、GalUA、Rib)。精密吸取该溶液0.4 mL，置于10 mL玻璃管中，再加入0.4 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，0.4 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混匀，置于70 ℃水浴中反应60 min，取出冷却至室温，加入0.4 mL 0.3 mol/L HCl中和，混匀，加入等量的氯仿涡旋2 min，静置5 min，弃去下层有机相，如此萃取3次，上清液过0.45 μm水性微孔滤膜，即得衍生物溶液。

1.3.5 液相色谱条件参考文献报道[20]，并做了调整优化。实验选用的液相色谱条件见表1。

表1 液相色谱条件

(续表1)

2 结果与讨论

2.1 方法学考察结果

考察了线性关系、检出限及线性范围。根据峰面积(Y)与进样质量浓度(X)建立回归方程来确定线性范围。将标准单糖溶液逐级稀释，依次进样，记录各组分的信号强度与空白样品的噪音强度，以3倍信噪比时相应质量浓度作为该组分的检出限(LOD)，结果见表2。

表2 6种单糖的标准曲线

仪器精密度考察及结果：将2.1942 mg/mL的标准单糖混合液衍生化后，连续进样6次，计算其相对标准偏差(RSD)。Rha、GlcUA、GalUA、Gal、Ara、Fuc、Man、Rib、Glc和Xyl的RSD分别是0.52%、0.77%、2.37%、0.92%、1.54%、2.28%、0.56%、0.14%、0.12%、0.39%。

溶液稳定性考察及结果：将衍生化后的混标样品于4 ℃保存，每隔4 h进样一次，共进样6次，计算RSD。Rha、GlcUA、GalUA、Gal、Ara、Fuc、Man、Rib、Glc和Xyl的RSD差分别是0.16%、0.39%、0.16%、0.13%、2.77%、3.13%、1.81%、0.77%、1.20%、0.65%。

方法重复性考察及结果：平行配制同一批样品6份，水解衍生化后测定，每一个样品连续进样3次，计算6种单糖的含量，见表3。

表3 刺梧桐胶多糖样品水解产物中单糖含量的测定结果(n=6)

回收率考察及结果：精密称定刺梧桐胶多糖样品50.17 mg，按实验方法进行水解衍生化。准确称取5.37 mg Rha、4.08 mg Gal、4.42 mg GlcUA、4.12 mg GalUA、4.22 mg Ara、4.12 mg Fuc，分别置于2 mL 容量瓶中，加水定容，混匀，每个单糖精密移取200 μL混匀，精密移取1 mL定容至2 mL为高浓度组。精密移取高浓度组溶液1 mL于2 mL容量瓶中，加水定容，混匀，为中浓度组。精密移取中浓度组溶液1 mL 于2 mL容量瓶中，加水定容，为低浓度组。每组各精密移取0.4 mL于10 mL玻璃管中，进行衍生化后，高、中、低组各取0.5 mL，分别与0.5 mL样品混合，即得。按HPLC条件进行测定，重复测定3次，计算回收率，结果见表3。

表4 加标回收率测定结果

从上述结果可以看出，方法RSD小于3%，不同质量浓度的加标回收率在96.80%～101.26%之间，说明柱前衍生化-HPLC法适用于分析刺梧桐胶多糖水解液中单糖的组成。

刺梧桐胶水解物的衍生化-HPLC色谱图见图1。

图1 混合标准单糖(A)和自制刺梧桐胶多糖水解物(B)的PMP衍生物HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards(A) and hydrolyzed polysaccharides(B) from Karayagum by PMP derivatization1.Man；2.Rib；3.Rha；4.GlcUA；5.GalUA；6.Glc；7.Gal；8.Xyl；9.Ara；10.Fuc.

2.2 不同等级刺梧桐胶多糖提取率及其单糖含量的测定

由表5和表6可以看出，单糖组分的含量在0.5～150 mg/g之间，不同等级的自制刺梧桐胶多糖均含Rha、GalUA、GlcUA和Gal 4种单糖组分。其中，Rha的含量最高，在100～150 mg/g之间，占总糖含量的40.79%～43.28%，Gal和GalUA次之，Ara和Fuc含量较少，与文献报道[4]的43%D -半乳糖醛酸、14%D -半乳糖、15%鼠李糖和以及少量的葡萄糖醛酸不一致，可能是产地不同的原因。也可以看出Ara在缅甸A、B级中没有检测出来，Fuc在缅甸D级中没有检测出来，可能是含量过低。

表5 不同等级刺梧桐胶多糖提取率及单糖糖含量测定结果(n=3)

表6 不同等级刺梧桐胶单糖物质的量比(n=3)

3 结论

本实验采用PMP柱前衍生化-高效液相法分析出刺梧桐胶多糖单糖组成为Rha、Ara、Gal、GalUA、Ara和Fuc，故只定量分析了这6种单糖的含量和加标回收率。经方法学验证，该方法操作简单、适用性强、稳定性好，可用于刺梧桐胶多糖和其他多糖的单糖组成分析。对不同等级的刺梧桐胶多糖进行分析鉴定，结果表明：不同等级的刺梧桐胶多糖的单糖组成均含Rha、GalUA、GlcUA和Gal 4种单糖组分，其中Ara在缅甸A、B级中没有检测出来，Fuc在缅甸D级中没有检测出来，可能是因为含量过低。