不同类型文冠果不同花期的挥发性物质及其释放量的变化规律1)

胡杨 李钢铁 王倩玉 张玲 李珊珊 王亮生 乌志颜

(内蒙古农业大学，呼和浩特，010018) (中国科学研究院植物研究所北方资源植物重点实验室) (赤峰市林业科学院)

花的挥发性成分是植物挥发性成分的重要组成部分，大自然中很多植物都会散发香味，而植物散发的这些香味的成分可以帮助植物传播讯息和抑制杂草的生长，抵御病虫害和细菌以免腐烂，还能吸引昆虫来授粉[1]。植物花朵挥发性成分的释放是随着花朵的开放散发的，并且释放量也会发生一定的变化。如西伯利亚百合(Lilium‘Siberia’)[2]、双瓣茉莉(Jasminumsambac(L.) Aiton)[3]、鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl)[4]等植物花朵挥发性的散发在不同的花期会呈现出不一样的变化规律，从总体上看均是半开期和盛开期的释放量较高。由于花香在植物自我保护与观赏品质提高等方面的重要作用，植物花香研究愈来愈受到人们重视，成为植物基础研究的热点之一。

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)别称文官果、文登果、蒙文僧灯毛道，隶属于无患子科(Sapindaceae)文冠果属(Xanthoceras)，是一种落叶灌木或小乔木。文冠果是我国独有，且生长在北方的珍贵的乡土木本油料树种，此树种耐干旱、耐严寒、耐风沙、耐瘠薄。近年来，相关政府部门计划在河北、内蒙、山西、辽宁、陕西、青海、甘肃、新疆、河南、吉林、黑龙江11省区规划建设文冠果能源林[5]，随着文冠果产业的发展以及国家政策的扶持，文冠果种植面积亦会不断增加，因此，进一步开发文冠果的价值十分必要。由于文冠果繁花少实和落花落果现象严重，结实量不高，这种现象很大程度上影响了文冠果的开发利用[6]。但是，文冠果的花朵繁密，花期持续时间长达20 d，大面积种植可形成花海景观，是优良景观树种；但具有芳香的树种较少，所以开展文冠果花香性状的研究，可为扩大文冠果的开发利用价值奠定理论基础。

目前在百合(Liliumspp.)[7]、玫瑰(RosarugosaThunb)[8]、茉莉(Jasminumsambac(L.) Aiton)[9]、波叶金桂(Osmanthusfragrans‘Boyejingui’)[10]、小苍兰(Freesia)[11]、姜花(Hedychiumcoronarium)[12]等花卉中已有挥发性研究的报道，而文冠果的挥发性研究只在李斌等[13]调查筛选文冠果观赏类型植株时提到过，带香味的文冠果花期较早，靠近会有淡淡的香味散发出来，而剩余植株的花朵没有明显的香味，因为这种类型在文冠果中比较特殊，故单列为一种类型即有香型。此种类型较为罕见，仅在其调查的文冠果基地发现1株。张秀丽等[14]、段树生等[15]均进行了观赏文冠果的种质筛选，其中筛选到数株有香型文冠果，但并未对其挥发性物质进行研究。至今国内外还没有文冠果挥发性成分分析的相关文献报道，且文冠果育种关注点目前多在丰产方面，对于有香型文冠果品种选育还缺乏深入研究。笔者以两个常见文冠果观赏类型白花型和红花型为对象，利用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析文冠果不同开花期挥发性成分的组成和释放量的差异，揭示其花香成分组成及其释放量在不同开放时期的变化规律，对文冠果花的鉴赏和阐明释香机制具有理论参考价值，为文冠果的芳香型育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为具有代表性的两种文冠果观赏类型白花型(图1)和红花型(图2)，其中分别选取了白花型无香一种(W-N-1)，有香两种(W-Y-1、W-Y-2)；红花型有香(R-Y-1)和无香(R-N-1)各一种。样品采自山东沃奇农业开发有限公司及内蒙古文冠庄园农业科技开发有限公司的文冠果基地。于2019年4月在山东和2019年5月在赤峰的文冠果开花期间(文冠果花期一般可以持续20 d左右)，晴朗无风、光照良好的上午09:00—10:00分别采取4个不同花期的花朵，即每个品种在生长势一致的3棵植株上分别采花苞期(开花前一天左右，部分小花顶端出现孔隙)、初开期(约10%花朵开放，大部分半闭合)、半开期(约50%花朵开放，小部分半闭合)、盛开期(70%以上的花朵开放，花被反卷)[16]的文冠果花样品，采摘后立即返回实验室进行挥发性成分测定。

图1 文冠果白花型不同花期的形态特征

图2 文冠果红花型不同花期的形态特征

1.2 仪器

SPME手动固相微萃取进样器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头为美国Supelco公司产品；气相色谱-质谱联用仪为美国Agilent公司产品，为7890B GC系统及7000C MS。

1.3 HS-SPME分析方法

先将DVB/CAR/PDMS纤维萃取头在气相色谱的进样口进行老化，老化温度为250 ℃，老化时间1 h。然后将文冠果鲜花1 g样品加入20 mL顶空进样瓶中，同时加入10 μL 0.05 mg/mL的3-辛醇(3-octanol)作为内标，用铝盖加聚四氟乙烯硅胶隔垫密封。在恒温水浴锅中40 ℃恒温30 min，然后将经过老化的DVB/CAR/PDMS纤维头通过隔垫插入顶空瓶中，萃取头固定于样品上方1 cm处，顶空萃取20 min。然后立即将萃取头插入GC进样口，解吸3 min，进行GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析方法

色谱条件：HP-5MS弹性石英纤维毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为高纯度氦气，流速为1 mL/min，分流比为2∶1，进样口温度250 ℃；程序升温为初始温度为55 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至210 ℃，保持1 min，后运行温度为以210 ℃，保持2 min。

质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃。使用全扫描模式，且质荷比为45～600。

1.5 数据分析

挥发性组分经气相色谱分离，不同组分形成其各自的色谱峰，用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。定性方法：对采集到未知化合物的质谱图通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00检索，并与图谱库(NIST14)的标准质谱图进行对照分析，结合人工图谱解析及资料分析，试验仅取正反匹配度800～1 000的鉴定结果。定量方法：选择3-辛醇为内标，其质量分数为40.9 ng/g，体积为10 μL，通过内标法进行定量分析。利用Excel软件进行数据统计及制表，采用SigmaPlot 12.5软件作图。

2 结果与分析

经GC-MS分析，从白花型文冠果与红花型文冠果这两种观赏类型中初步鉴定出42种花朵挥发性成分，可分为7大类，分别为萜烯类16种，主要为cis-β-可巴烯、δ-杜松烯；醇类9种，主要为芳樟醇和1-辛烯-3-醇；酯类7种，主要为2-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、水杨酸甲酯和水杨酸乙酯；醛类5种，主要为苯甲醛，反式-2-己烯醛和壬醛；烷烃类3种，主要为正十三烷；此外还有1种酮类化合物为3-辛酮和1种含N类化合物为喹啉(表1、图3)。

表1 不同类型文冠果不同开花期可检测的挥发性成分及其释放量 ng·g-1

续(表1) ng·g-1

注：表中数值为平均值±标准差；“-”表示未检测到。

图3 不同类型文冠果半开期挥发性成分总离子流图

2.1 文冠果白花型和红花型挥发性成分的比较

文冠果白花型和红花型的挥发物总释放量以W-Y-1最高(表2)，达到1 414.68 ng/g；W-Y-2和R-Y-1次之，分别为681.19和634.79 ng/g；W-N-1和R-N-1最低，分别为198.18和154.74 ng/g。对7大类花朵挥发物的释放量进一步分析可以看出，白花型和红花型两个类型挥发性成分分别有43和15种，在4个时期共检测到42种挥发性成分，共有成分仅4种，为反式-2-己烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和3-辛酮。对挥发性贡献较大的化合物，红花型和白花型两种之间也有比较明显的不同(表3)。红花型不含有烷烃类、酯类和含N化合物，且萜烯类释放量很少，白花型的挥发性成分主要由萜烯类、醇类和醛类贡献，红花型主要由醇类和醛类贡献。醇类物质在各个文冠果品种中的数量相对来说较多，是文冠果花香中主要的挥发物，在不同接受测试的品种中其数量也存在较大差异。W-Y-2花的主要挥发性成分是萜烯类、醇类、酯类和醛类物质，是参试品种中感官上最香的一种，但其挥发性成分释放量并非参试品种中最高的，推测是挥发性成分中微量成分与主要成分间协同作用结果。

表2 不同类型文冠果不同开花阶段挥发性成分释放总量

2.2 文冠果有香型和无香型挥发性成分的比较

白花型和红花型文冠果中无香的为W-N-1和R-N-1，有香的为W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1。有香型和无香型分别检测到挥发性成分分别有36和26种(表4)，有香型的主要挥发物类型多为醇类，无香型的挥发物类型种类虽多，但是释放量都较少，且有香型的总释放量比无香型的要高。有香型的主要挥发物质为芳樟醇，无香型的主要挥发物质为1-辛烯-3-醇和苯甲醛，并且W-N-1和R-N-1虽检测到有醇类化合物，但是未检测到芳樟醇，这是有香型文冠果和无香型文冠果最主要的区别。正十三烷和正十五烷为白花型有香的特有成分，β-波旁烯、大根香叶烯、3-蒈烯为W-Y-2的特有成分，(+)-β-柏木烯为R-N-1的特有成分，但是这些特有成分的共同特点是释放量不高。有香型中W-Y-2较为特殊，其释放量较高的物质如反式-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、苯甲酸乙酯、水杨酸甲酯、水杨酸乙酯和喹啉均是在花苞期时释放量最高，在其他时期明显下降，总释放量也是为花苞期最高。W-Y-1和R-Y-1中的醇类极其高，分别占其总释放量的96.34%和96.69%，W-Y-2中也是醇类释放量较高，为45.74%，其中芳樟醇为主效成分。芳樟醇释放量在花朵的开放进程中释放规律也不一样(表3)，在W-Y-1和R-Y-1中从花苞期开始明显呈上升趋势，W-Y-2变化不太明显。

表3 不同类型文冠果不同开花阶段芳樟醇释放量

2.3 文冠果白花型和红花型开花过程中花香物质的变化

2.3.1 白花型文冠果挥发性成分及释放规律

W-N-1花瓣不同发育时期所含的挥发性成分共25种。花苞期，W-N-1检测到挥发性成分19种，释放量达18.29%；初开期，检测到挥发性成分17种，释放量达18.31%；半开期，检测到挥发性成分18种，释放量达30.63%；盛开期，检测到挥发性成分18种，释放量达32.77%(表4)。可见，W-N-1挥发性成分总释放量呈现自花苞期逐渐上升，初开期微升，至半开期升高，盛开期缓升的趋势。W-N-1检测到的6类挥发性成分中，萜烯类物质释放量为最高，盛开期达到最高为54.47%，其中cis-β-可巴烯释放量最高，次高为δ-杜松烯，在W-N-1开放进程中一直呈上升趋势，苯乙烯为花苞期及此品种特有成分，不过释放量很低为0.24%。醛类和醇类的释放量均较高，反式-2-己烯醛和反-2-,顺-6-壬二烯醛只在花苞时期出现，苯甲醛和壬醛在初开期开始出现，苯甲醛释放量较高，醇类中只有1-辛烯-3-醇贯穿开放进程，在盛开期达到最高，此外，正辛醇为此时期所特有，但释放量都不高。酯类、酮类和含N类物质释放量不高，未检测到烷烃类物质。W-N-1的主要挥发性成分为cis-β-可巴烯、δ-杜松烯、1-辛烯-3-醇和苯甲醛。

W-Y-1花瓣不同发育时期所含的挥发性成分共9种。花苞期，检测到挥发性成分7种，释放量达9.47%；初开期，检测到挥发性成分3种，释放量达27.87%；半开期，检测到挥发性成分4种，释放量达32.5%；盛开期，检测到挥发性成分4种，释放量为30.16%(表4)。可见，挥发性成分释放量总体变化呈现花苞期最低—初开期微升—半开期最高—盛开期降低的变化规律。根据表1还可知，W-Y-1整个开放进程中检测到的6类9种挥发性成分中，醇类释放量最高，达96.34%；其中芳樟醇是释放量最高的醇类，释放量为93.72%。其它的5类物质中，萜烯类只在初开、半开和盛开(非花苞)时期检测到一种挥发性成分3-蒈烯，且释放量较低；醛类物质在初开期没有检测到物质，其他时期检测到2种挥发性成分，释放量不高，其中壬醛为半开盛开时期的特有成分；酯类、烷烃类和酮类物质只在花苞时期各检测到1种物质，其释放量很小或极低；含N类化合物未检测到。综上分析，W-Y-1的主要挥发性成分为芳樟醇。

W-Y-2花瓣不同发育时期所含的挥发性成分共32种。花苞期中有检测到25种化合物，释放量达31.84%；初开期，检测到挥发性成分16种，释放量达19.83%；半开期，检测到挥发性成分18种，释放量达20.62%；盛开期，检测到挥发性成分20种，释放量为27.71%(表4)。可见，挥发性成分释放量在花苞时期最高，自初开期逐渐上升，至盛开期达到最高。W-Y-2整个开放进程中检测到的7类33种挥发性成分中，醇类释放量最高，为45.74%；其中芳樟醇是释放量最高的醇类，释放量为36.37%。萜烯类释放量次高，为19.26%，大根香叶烯、β-波旁烯、δ-杜松烯和γ-依兰油烯在4个时期中均可检测到，并且释放量呈持续增长的趋势；大根香叶烯是释放量最高的萜烯类，此挥发性成分为W-Y-2的特有成分，在非花苞时期检测到3-蒈烯，且释放量较低；花苞时期特有成分为β-依兰烯，α-可巴烯、γ-杜松烯、1-表二环倍半水芹烯为盛开期特有成分，但是释放量较低。酯类和醛类中大部分只在初开期出现，酯类中的水杨酸乙酯和醛类物质中苯甲醛和壬醛贯穿整个开放过程，但在芳香浓郁的盛开期水杨酸乙酯的释放量为各时期最低，看来酯类不是主要挥发性成分。苯甲醛和壬醛释放量呈持续上升的趋势，且苯甲醛在盛开期较高。含N类化合物只检测到喹啉，花苞时期的释放量最高为13.37%，然后持续降低，盛开期未检测到。烷烃类释放量较低，且在盛开期释放量反而降低。酮类物质释放量极低。可得，W-Y-2的主要挥发性成分为芳樟醇、大根香叶烯和苯甲醛。

2.3.2 红花型文冠果挥发性成分及释放规律

R-N-1花瓣不同发育时期所含的挥发性成分共11种。花苞期，检测到挥发性成分6种，释放量达23.23%；初开期，检测到挥发性成分5种，释放量达13.33%；半开期，检测到挥发性成分8种，释放量达27.44%；盛开期，检测到挥发性成分6种，释放量为36%(表4)。此品种的挥发性成分释放量规律为花苞时期较高，初开期降低然后半开期逐渐上升，至盛开期达到最高。R-N-1整个开放进程中检测到的4类11种挥发性成分中，醇类释放量最高，为39.72%；其中1-辛烯-3-醇是释放量最高的醇类，释放量为33.9%，3-己烯-1-醇只在花苞期检测到，正辛醇和1-壬醇只在半开期检测到，且释放量较低。醛类释放量次高，为19.15%；苯甲醛释放量最高，且在4个时期中均可检测到，释放量呈持续增长的趋势；反式-2-己烯醛虽可检测到，但是释放量持续降低；壬醛只能在半开期检测到且释放量不高。萜烯类中的(+)-β-柏木烯为R-N-1的特有成分，与cis-β-可巴烯只在盛开期出现且释放量较低，苯乙烯反而在盛开期未检测到。酮类中只检测到3-辛酮，其释放量呈持续上升的趋势，且在盛开期达到最高。酯类、烷烃类和含N类化合物均为检测到。可得，R-N-1的主要挥发性成分为1-辛烯-3-醇、苯甲醛。

R-Y-1花瓣不同发育时期所含的挥发性成分共8种。7种挥发性成分在花苞期被检测到，释放量达5.94%；初开期，检测到挥发性成分5种，释放量达26.86%；半开期检测到挥发性成分4种，释放量达35.49%；盛开期，检测到挥发性成分5种，释放量为31.07%(表4)。此品种挥发性成分释放量呈现花苞期至半开期上升，然后盛开期降低的变化规律。根据表2可得，R-Y-1在4个时期共检测到的3类9种挥发性成分中，醇类释放量最高，释放量高达96.69%；其中芳樟醇是释放量最高的醇类，释放量为85.45%；反式-2-己烯-1-醇为花苞时期特有成分，反式氧化芳樟醇释放量呈增长的趋势，但是这两种挥发性成分都释放量较低。醛类物质只在花苞期检测到反式-2-己烯醛，盛开期检测到壬醛。酮类物质只在花苞和初开时期检测到1种物质，其释放量很低。萜烯类、酯类、烷烃类和含N类化合物均未检测到。通过分析可知，R-Y-1的主要挥发性成分为芳樟醇。

表4 文冠果挥发物的释放量与成分种类数量

3 讨论与结论

观赏树种的重要性状之一就是花香，醇类和萜烯类化合物在许多植物的花香成分中占有很大比例，如在牡丹中发现α-蒎烯、香叶醇和香茅醇的释放量最高[17]；在柑橘花中发现芳樟醇、柠檬烯和月桂烯为主要挥发性成分[18]；在大马士革玫瑰中发现主要挥发物包括香茅醇，香叶醇[19]。本试验分析了文冠果花瓣不同开放时期的挥发性成分，检测到了42种挥发物，结果表明不同类型文冠果挥发性物质种类及释放量都存在差异，整体上有香型文冠果挥发性成分主要以醇类、萜烯类和醛类为主，少量的烷烃类、酯类、酮类和含N类物质为辅。另外，不同生长地区的植物、植物花朵的开放状态，采收季节等因素同样会造成挥发性成分的不稳定性。本研究分析了白花型和红花型文冠果花瓣的挥发性成分，其花香成分可分为萜烯类、醇类、醛类、酮类、酯类、烷烃类和含N化合物7大类，并且化合物数量及其释放量随花期表现出先增大后减小的规律，主要化合物基本在盛开期达到最大，其主要挥发性化合物类型为醇类、萜烯类和醛类，且在开放进程中均是醇类物质释放量最高，其次为萜烯类和醛类，并鉴定出其主要挥发性物质包括芳樟醇、大根香叶烯、1-辛烯-3-醇和苯甲醛等。同时还发现白花型和红花型所含挥发性成分差异较大，白花型含有本次检测得到的7大类化合物，红花型不含有7大类挥发性化合物中的酯类、烷烃类和含N类化合物，但是两种花型在感官上都具有很好的香味，因此，挥发性成分的复杂性对于挥发性的贡献还有待于深入研究。

花朵主要芳香挥发物质的释放会随着花瓣的开放而逐渐显现出来[20]，本研究采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)研究了白花型和红花型文冠果4个发育时期挥发性成分与释放量的变化，在4个时期检测到的花香成分中醇类和萜烯类化合物是主要物质成分。随着花朵的开放，酯类和含N类化合物成分的释放量逐渐降低，萜烯类成分的释放量逐渐增加，醇类和烷烃类成分的释放量先增加后降低，醛类和酮类成分的释放量先降低后增加，且主要挥发性组成成分的释放量均在半开期最高。从文冠果的花香成分分析发现无香型文冠果花W-N-1和R-N-1中没有检测到芳樟醇，有香型文冠果W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1这3个以醇类为主的参试品种普遍在感官上有明显的花香，这与其中大量存在芳樟醇有关，且W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1花中芳樟醇释放量分别占总释放量的93.72%、36.37%和85.49%，可初步确定芳樟醇为文冠果花朵释香的关键成分。文冠果花瓣挥发性成分检出的芳樟醇这一主要成分，不仅释放量高，而且具有应用价值。芳樟醇是一种用途广，用量大的香料品种，是香水香精等日化产品中使用频率最高的单方香料，它的主香是铃兰花型挥发性，常用与合成其他芳樟酯类香料，需求量很大[21]。发现W-Y-1和R-Y-1含有芳樟醇类活性物质释放量占总释放量的80%以上，可以进一步研究作为芳樟醇类物质产业开发的品种。

由气相色谱-质谱联用的分析结果可知，从白花型文冠果与红花型文冠果这两种观赏类型中鉴定出萜烯类、醇类、酯类、醛类、烷烃类、酮类和含N类化合物共7类42种花朵挥发性化合物。在不同类型文冠果不同花期的挥发性组分及其释放量的差异较大，白花型文冠果的挥发性成分组成比红花型文冠果的丰富，有香型文冠果(W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1)和无香型文冠果(W-N-1和R-N-1)最主要的成分区别在于有香型文冠果中含有芳樟醇，而无香型文冠果中不含有芳樟醇。总体上醇类和萜烯类成分是文冠果花释香的关键成分，主体成分是芳樟醇，且主要挥发性成分的释放量均在半开期最高。通过对文冠果不同花期花瓣的挥发性成分开展测定分析，掌握文冠果花香成分组成和释放量的差异变化，对文冠果花的鉴赏和芳香型育种提供理论参考。