石油烃降解菌降解性能及其对含油土壤的修复

李敏，李婷婷，彭湃，王恩彪，孟垚，李彦成，侯欣园，杨思宇，魏小娜＊

（1. 辽宁石油化工大学，辽宁 抚顺 113001； 2. 沈阳化工研究院有限公司，辽宁 沈阳 110021）

据统计，全世界每年进入环境的石油烃累计约800 万t，大量石油烃最终归口于土壤，其带来的土壤污染问题日益突出。因此，石油烃污染土壤修复备受关注[1]。

微生物修复技术不会引起土壤结构改变和二次污染，被广泛应用于含油土壤的修复[2]。但是，单一菌株降解效果差，且降解速率随着时间延长不断降低。构建复合菌群可利用不同菌株的协同作用，获得较好的石油烃降解效果[3]。然而以游离菌形式进入土壤的大部分外源降解菌易受土壤微环境变化、污染物本身的影响，不易定殖，难以达到预期效果。微生物固定化技术通过将微生物固定在相应的载体上，使微生物在适宜条件下能够快速、大量增殖并保持生物活性[4]。选择适宜的固定化载体还可对土壤产生一定的保水作用，提高土壤营养物质含量，提高微生物对有机质、全氮和速效磷的利用率[5]。

本研究考察了筛选出的3 株石油烃降解菌去除石油烃的性能，采用吸附法制备固定化菌剂，比较了降解菌不同引入方式对污染物的去除性能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 污染物

所用石油为大庆油田原油，密度为0.858 g·cm-3（20 ℃），凝固点为25.6 ℃，黏度为20.9 mPa·s（50 ℃），该石油中饱和烃、芳香烃和胶质沥青质所占比例分别为60.5%、33.5%和6.0%。

1.1.2 供试土壤

土壤取自辽宁省彰武县无污染的土壤，采集20～40 cm 土层样品，经风干、碾碎，去除残根等杂质，过2 mm 筛，后续用于微生物修复实验。土壤的理化性质见表1。

石油烃污染土壤制备：取石油50 g 溶解于500 mL 丙酮，分散均匀后，边搅拌边添加到1 000 g土壤中；25 ℃避光条件下通风老化，每日早晚各搅拌一次；待丙酮挥发完全后继续通风老化10 d，进行灭菌处理，初始石油烃质量分数为44.32 g·kg-1，备用。

1.1.3 培养基

无机盐培养基：MgSO4·7H2O 为0.5 g·L-1，CaCl2为0.02 g·L-1，KH2PO4为1.0 g·L-1，NH4Cl 为2.0 g·L-1，FeCl3为0.05 g·L-1，pH=7。

LB 培养基：蛋白胨为10 g·L-1，酵母膏为5 g·L-1，氯化钠为10 g·L-1，琼脂粉为15 g·L-1， pH=7.2，121℃灭菌30 min。

1.1.4 供试菌株

采用前期实验从油田含油污泥中筛选出的C3、C4、C5 3 株具有石油烃降解性能的菌株作为供试菌株，经16S rDNA 序列与Gene Bank 中已知序列进行比对，并结合生理生化实验结果，确定 C3 为Pseudomonas putida ， C4 为Acinetobacter calcoaceticus，C5 为Sphingomonas sp.。

1.2 实验方法

1.2.1 原油降解率测定

按正交优化条件下的最佳接种比例将3 株单菌的菌悬液进行混合得复合菌剂。将活化至对数生长期的单菌株和复合菌悬液（约109 cfu·mL-1）2 mL接入100 mL 含0.5%石油烃的无机盐培养基中，以不接菌的100 mL 含0.5%石油烃的无机盐培养基作为对照，于30 ℃、180 r·min-1恒温振荡摇床分别培养28 d。用三氯甲烷萃取培养基中的残余油分，采用红外分光光度法测定石油烃质量分数。细菌生长以波长600 nm 处的浊度OD600 表示。每个处理设置3 个重复。

1.2.2 固定化菌剂制备

取2.0 g 粒径为0.25 mm 的生物炭作为载体，高压灭菌后加入到100 mL LB 培养基中，接入6 mL复合菌悬液，30 ℃、150 r·min-1震荡培养36 h，离心得到的菌体用生理盐水洗涤2 次，即得固定化菌剂[6]。

1.2.3 不同菌剂加入方式对含油土壤的修复

称取1 kg 经过灭菌处理的石油烃污染土于花盆（直径 18 cm、高 25 cm）中，保持土壤35%的湿度。试验共设5 组处理：灭菌污染土（CK）、添加生物炭（BC）、添加游离复合菌剂（TB）、添加固定化菌剂（CTB）、添加游离复合菌+生物炭（TB+BC），其中游离复合菌和固定化菌剂含同等生物量（约3×109～8×109cfu·g-1），每个添加生物炭的处理生物炭添加量相同，每个处理设置3 个平行。分别于第 0、7、14、21、28 天进行取土样，测定土壤中石油烃质量分数，试验结束时测定土壤中的微生物量。

1.3 测试方法

采用梯度稀释法对固定化菌剂和游离复合菌剂生物量进行测定，具体方法为：将1.0 g 固定化菌剂加入锥形瓶中，加入100 mL 无菌水，180 r·min-1培养30 min。取菌液1 mL 进行梯度稀释后，进行涂布平板计数。游离复合菌剂培养液中细菌数量的确定亦取1 mL 生长至对数期的菌液进行梯度稀释，涂布平板计数[7]。计算1 mL 游离微生物菌液与1 g 固定化菌剂数量之间的关系[8]。

采用柱层析法分离石油烃族组分[9]，采用红外分光测油仪测定分离出的族组分含量。

2 结果与讨论

2.1 菌株的生长曲线及石油烃降解性能

如图1 所示，在发酵前期，发酵液中石油烃的质量分数随着菌体密度的增加而逐步降低。菌株C3的对数生长期为0～16 d，C4 的对数生长期为0～18 d，C5 的对数生长期为0～14 d。培养14 d 时，C3、C4、C5和复合菌石油烃降解率分别为30.58%、35.76%、29.45%、42.73%。菌株进入凋亡期后，对培养基中的石油烃降解速率放缓。培养28 d 时，C3、C4、C5 和复合菌对石油烃的降解率分别为45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。结果表明，3 株菌均可以石油烃作为唯一碳源和能源生长，对数生长期石油烃去除率与菌体生长密度呈正相关，前14 d 对石油烃的降解能力复合菌＞C4＞ C3＞C5。14～28 d 期间，C3、C4对石油烃的降解率仅增加14.23%和12.25 %，C5 和复合菌对石油烃的降解率增加了24.45%和37.00%。

图1 石油烃降解菌生长曲线及石油烃残留率变化

通过降解菌对石油烃不同组分的去除率（图2）分析，可见C3、C4 对饱和烃的去除率高于对芳香烃的去除率，C5 对芳香烃的利用能力要优于C3、C4，对烷烃的去除率在3 株菌种中最低。复合菌剂对饱和烃和芳香烃的去除率分别达到 84.93%和82.08%。这一现象可能与菌种对石油烃不同组分的选择性降解有关。如Pseudomonas细菌可利用石油烃各组分，而Acinetobacter对石油组分的降解能力为烷烃＞环烷烃＞芳香烃[10]，Sphingomonas则被认为对多种芳香族化合物具有高效降解能力[11]。通过对3 株菌的复配对石油烃各组分去除具有协同的效果，可大大提高石油烃去除率。

图2 石油烃降解菌生长曲线及石油烃残留率变化

2.2 不同处理石油烃降解率变化

含油土壤修复过程中石油烃降解率变化如图3所示。修复结束后，各处理石油烃平均降解率从高到低依次为CTB＞TB+BC＞TB＞BC＞CK。固定化复合菌对石油烃的去除率为78.32%，远高于其他处理。游离复合菌对石油烃平均降解率仅为45.81%，而在其生物量相当的情况在原油降解试验中游离复合菌对石油降解率达到79.73%，这是因为原油降解在理想的培养条件下进行，且石油烃含量相对较低，而土壤环境要复杂的多，石油烃易吸附于土壤颗粒上导致其生物可给性差。CK 组最终石油烃去除率为2.96%，可能源于某些组分的挥发。对比TB+BC、TB、BC 3 组处理可见，复合菌和生物炭的简单混合可在一定程度上提高石油烃的降解率，且其降解率要高于TB 和BC 组降解率之和，说明TB 和BC 联用对石油烃的去除具有协同效应，高于TB 和CK 的2 个对照组，它们的石油烃降解率为分别为46.81%、2.96%。固定化复合菌剂之所以能更好地促进石油烃降解，是由于生物炭在吸附大量菌体的同时，石油烃被吸附在生物炭的孔隙中，增加了石油烃降解菌与石油烃的接触，且生物炭表面的官能团，易解碳源和氮源有助于增强降解菌活性，进而提高石油烃降解率[12-13]。

图3 修复过程中石油烃降解率随时间变化

2.3 微生物数量

修复结束后各处理土壤微生物量如图4 所示，土壤样品中微生物数量由大到小顺序依次为CTB＞ TB+BC＞ TB。这说明，在修复石油烃污染土过程中，各处理石油烃降解菌株均能够在污染土壤中有效定殖。其中 CTB 处理组微生物数量为7.2×1010cfu·g-1，比初始增加了1 个数量级，TB 处理微生物数量较初始降低了1 个数量级，TB+BC 处理较初始略有降低。这说明生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，以固定化微生物方式加入土壤对降解菌的数量增加最为有利。这可能是由于以生物炭作为载体为降解菌提供了适宜的生存环境，减少土壤中石油烃对微生物细胞的毒害作用[14-15]，从而有助于石油烃降解菌株的定殖和石油烃的降解。

图4 修复结束后土壤微生物数量

3 结论

3 株石油烃降解菌株均能以石油烃为唯一碳源和能源生长， 30 ℃培养28 d 后，C3、C4、C5 和复合菌对石油烃的降解率分别为45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。C3、C4 对饱和烃的去除能力较强，C5 对芳香烃的去除能力较强，3 株菌复配后的复合菌对石油烃各组分的去除具有协同效果。

生物炭与复合菌联用对石油烃的去除具有协同效应，生物炭固定化复合菌对石油烃污染土壤修复效果最好，修复28 d 对石油烃的去除率为78.32%。

修复结束后，不同微生物添加方式下土壤中微生物数量表现出差异性，由大到小依次为CTB＞ TB+BC＞ TB。生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，其中生物炭作为固定化载体加入土壤对降解菌的数量增加最为有利。