文心兰杂交后代的EST-SSR 和SRAP 分子标记鉴定

林榕燕，罗远华，樊荣辉，叶秀仙，方能炎，钟淮钦，黄敏玲

（福建省农业科学院作物研究所/福建省特色花卉工程技术研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】 文心兰（Oncidiumhybridum）是兰科（Orchidaceae） 文心兰属（Oncidium） 及其近缘属的总称，由超过70 个属构成，文心兰属是其中最大的一个属[1]。其花色丰富、花型优美、花期长，是重要的盆花和切花种类[2]。目前，我国的文心兰产业虽已初具规模，但生产中栽培品种仍多为进口，自有品种相对较少[3]，培育性状优良、商品价值高、具有自主知识产权的新品种已成为文心兰育种的重要方向。现阶段，杂交育种依然是培育文心兰新品种最为常用的方法，相较于其他兰科植物，如蝴蝶兰、卡特兰等，文心兰无论是属内杂交还是属间杂交的育种难度均较大，花粉败育、杂交亲和力差、授粉结实率低等问题仍是障碍[4]。此外，文心兰从小苗到开花需要2～3 年，一个品种的选育周期要7～10 年[5,6]，因此，在文心兰杂交育种过程中，对其杂交后代进行杂种真实性的早期鉴定，筛选出所需要的真杂种是非常有必要的，不仅可以有效提高后代选择的准确性，还可以降低育种成本，缩短育种周期。【前人研究进展】 目前，植物杂交后代鉴定的方法有很多，传统的鉴定方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定等，具有周期长、成本高等问题[7]。随着分子生物学技术的发展，分子标记技术成为了植物杂交后代鉴定的高效技术手段之一，相较于传统的鉴定方法，分子标记技术为快速准确地鉴定出真杂交种提供了技术支撑。序列相关扩增多态性（SRAP）标记是一种基于PCR 的分子标记，具有高效、高共显性、重复性好等特点，前人的研究表明SRAP 标记适用于铁皮石斛[8]、大豆[9]、百合[10]等多种植物的杂交后代鉴定研究中。表达序列标签微卫星（EST-SSR）是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的分子标记，多应用于植物的遗传多样性分析、种质资源鉴定、重要性状标记等[11−13]。孙清明等[14]利用EST-SSR 标记进行了荔枝杂交群体真假杂种鉴定，实现了100%的鉴定效率，证明了EST-SSR 标记用于荔枝杂交后代鉴定是可行的。【本研究切入点】 本课题组前期通过人工杂交获得了一批后代株系[15]，若能对这些后代株系进行杂种真实性的早期鉴定，将有利于降低后期选择的难度，缩短新品种选育周期。基于EST-SSR 和SRAP 分子标记在植物杂交后代鉴定中的可行性，本研究拟利用EST-SSR 和SRAP 分子标记技术，对文心兰46 个杂交后代株系进行真实性鉴定。【拟解决的关键问题】本研究通过开展文心兰DNA 提取、PCR 扩增、引物筛选等试验，鉴定出这些杂交后代株系中的真杂种，并分析这些杂交后代株系间的亲缘关系及其与亲本间的遗传相似系数，以期为文心兰杂种后代的快速鉴定及加速育种进程提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以文心兰黄金午后（WilsonaraGolden Afternoon‘Rich Yellow’）、百万金币（OncidiumSweet Sugar‘Million Dollar’）及其46 个杂交后代株系（编号：1～46）为试验材料，其中，黄金午后为母本，百万金币为父本，两亲本的来源及主要性状见表1。供试的材料均取自福建省农业科学院作物研究所特色兰花工程化实验室育种圃。父母本及杂交后代株系均剪取幼嫩叶片，立即保存于液氮中，以待提取DNA。

表1 亲本来源及主要性状Table 1 Source and main traits of the parents

1.2 试验方法

1.2.1 叶片总DNA 的提取 采用改良CTAB 法[16]进行2 个文心兰品种及其杂交后代叶片总DNA 的提取，经1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其完整性和纯度后，将DNA 产物置于−20 ℃条件下保存备用。

1.2.2 文心兰SRAP-PCR 扩增 参考Budak 等[17]的引物，随机选择11 条正向引物和16 条反向引物，组成176 对引物组合。PCR 反应体系的总体积为25 μL，其中DNA 模板、上游引物、下游引物均为1.0 μL，含Mg2+的Buffer 为2.5 μL，2.5 mmol·L−1的dNTPs 为2.0 μL，Taq聚合酶为0.3 μL，ddH2O 为17.2μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 预变性5 min；5 个循环的94 ℃变性、35 ℃ 复性、72 ℃ 延伸；30 个循环的94 ℃ 变性、50 ℃ 复性、72 ℃ 延伸；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物利用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，经紫外凝胶成像仪拍照，获得电泳图谱。

1.2.3 文心兰EST-SSR-PCR 扩增 基于本课题组前期设计的21 对文心兰EST-SSR 标记引物[18]，进行PCR扩增。PCR 反应体系的总体积为25 μL，同SRAP-PCR反应体系。PCR 扩增程序为：94 ℃ 预变性 4 min、变性30 s；各引物对应退火温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min，并保存于4 ℃条件下。PCR 扩增产物先通过2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，后经紫外凝胶成像仪拍照，获得电泳图谱。

1.2.4 文心兰杂交后代真实性鉴定 参照Hulya[19]的方法，从供试的SRAP 引物组合和EST-SSR 引物对中筛选出具有父本特征条带的引物组合，观察这些引物的扩增条带图，若杂交后代株系扩增出的条带中具有父本特征条带，则该杂种鉴定为真杂种。

1.2.5 数据分析 观察分析电泳图谱，对其中的DNA条带数进行统计，在同一迁移位置上有扩增条带的记作1，无条带的则记作0，在EXCEL 软件构建（1,0）原始数据矩阵。基于数据矩阵，利用EXCEL软件计算引物的多态性比率和多态性信息含量，利用NTSYS-pc2.10e 软件绘制亲本与杂交后代间的遗传距离矩阵与遗传相似系数矩阵。而后根据遗传距离矩阵进行聚类分析，获得聚类图；基于相似系数矩阵数据，在EXCEL 软件中计算最小值、下四分位数、中位数、四分位数、最大值，并根据不同数值间的差值绘制亲本与杂种间的遗传相似系数箱式图。

2 结果与分析

2.1 文心兰EST-SSR 引物和SRAP 引物的初筛选

将获得的48 份文心兰材料DNA 稀释至相同浓度备用，以父母本及随机2 份杂交后代株系为模板进行21 对EST-SSR 引物和176 对SRAP 引物的初步筛选，筛选出能扩增出明显条带的9 对EST-SSR引物和15 对SRAP 引物。为明确筛选引物对其他文心兰品种的可用性，利用筛选出来的共24 对引物对供试的48 个样品进行扩增，发现6 对EST-SSR 引物和10 对SRAP 引物在48 个样品中均能扩增出清晰条带，且父本能扩增出母本没有的特异性条带。

2.2 杂交后代的真实性鉴定

利用筛选出的 6 对EST-SSR 引物对46 个杂交后代株系进行真实性鉴定（表1），在引物Hga19 的扩增条带中发现了6 条父本特征带，且供试的 46 个杂交后代株系均具有父本特异性条带，记录为真杂种；此外，引物Hga15 的扩增条带中有2 条父本特征带，鉴定出46 个杂交后代株系均为真杂种，鉴定效率达100%（图1-A）。而引物Htag5 仅鉴定出10 个杂交后代株系，鉴定效率为21.74%。综合6 对EST-SSR引物的鉴定结果，供试的46 个杂交后代株系均鉴定为真杂种，鉴定效率为100%。

图1 文心兰杂交后代的EST-SSR 引物Hga15（A）和SRAP 引物组合Me1+Em3（B）鉴定结果Fig. 1 Identification of Oncidium hybrid progenies using EST-SSR primer Hga15 (A) and SRAP primer combinations Me1+Em3 (B)

利用筛选出的 10 对SRAP 引物组合对46 个杂交后代株系进行真实性鉴定（表2），发现在Me1+Em3引物组合的扩增结果中（图1-B），供试的 46 个杂交后代株系均具有父本特异性条带，鉴定为真杂种，鉴定效率达100%；Me6+Em8 及Me10+Em2 引物组合同样鉴定出46 个杂交后代株系均为真杂种，鉴定效率达100%；在Me3+Em1 引物组合的扩增结果中，鉴定出33 个杂交后代株系为真杂种，鉴定效率为71.74%。此外，在父本特征条带比较中，Me8+Em1引物组合扩增出的父本特征条带最多，为7 条。综合10 对SRAP 引物组合的鉴定结果，鉴定效率同样为100%，46 个杂交后代株系均鉴定为真杂种。

表2 文心兰杂交后代鉴定的EST-SSR 和SRAP 标记引物信息Table 2 Information on EST-SSR and SRAP primer pairs used for Oncidium hybrid progeny identification

2.3 EST-SSR 和SRAP 引物的多态性分析

对筛选出来的6 对文心兰EST-SSR 引物进行多态性分析发现，每对引物平均扩增到6.5 个条带，其中多态性条带数在5.67 个，各引物的多态性比率分布为75.00% ～100.00%。引物Hga19 扩增出9 条多态性条带，其多态性信息含量最高，为0.87；引物Hga15 仅扩增出3 条多态性条带，其多态性信息含量最小，为0.66；供试的6 对文心兰EST-SSR 引物平均多态性信息含量为0.80（表3）。

对筛选出来的10 对SRAP 引物组合进行多态性分析发现，10 对引物组合共扩增出99 个条带，其中多态性条带数有81 个，多态性比例为81.82%。Me7+Em1 和Me10+Em2 引物组合的多态性比例为100.00%，Me6+Em8 引物组合的多态性比例仅为66.67%。在多态性信息含量比较中，Me8+Em1 引物组合最高，为0.92；Me3+Em1、Me6+Em2、Me6+Em7 和Me7+Em1引物组合的多态性信息含量均为0.85；供试的10 对SRAP 引物组合平均多态性信息含量为0.87（表3）。

表3 文心兰EST-SSR 和SRAP 引物多态性分析Table 3 Polymorphism of EST-SSR and SRAP primer pairs ofOncidium

2.4 文心兰亲本与杂交后代株系的聚类分析

基于EST-SSR 和SRAP 的扩增结果建立（0,1）型数据，利用NTSYS-pc2.10e 软件，构建文心兰亲本与杂交后代株系的聚类图。从聚类图（图2）可以看出，供试的48 个文心兰材料间的遗传距离变化在0.04～0.36，其中，1 号杂交后代株系和2 号杂交后代株系的亲缘关系最近，父本百万金币与其他品种存在较大的遗传差异。在遗传距离为0.28 处，供试的48 个文心兰材料分为3 大聚类群：第Ⅰ类包括46 个杂交后代株系； 第Ⅱ类为母本黄金午后；第Ⅲ类为父本百万金币。供试的46 个杂交后代株系在遗传距离上均与母本黄金午后更为接近，表现为偏母性遗传。

图2 基于EST-SSR 和SRAP 分子标记的文心兰聚类分析Fig. 2 Clustering Oncidium based on EST-SSR and SRAP molecular markers

2.5 文心兰亲本与杂交后代的遗传相似性分析

根据EST-SSR 和SRAP 的扩增结果， 利用NTSYS-pc2.10e 软件构建文心兰亲本与杂交后代株系的遗传相似系数矩阵。在遗传相似系数矩阵数据中，母本黄金午后与父本百万金币间的遗传相似系数仅为0.36，为遗传相似系数矩阵中的最低值。基于遗传相似系数矩阵，利用EXCEL 绘制亲本与杂交后代的遗传相似系数箱式图（图3）。发现父本百万金币与杂交后代株系间的遗传相似系数在0.51～0.64，遗传相似系数平均值为0.57；母本黄金午后与杂交后代株系间的遗传相似系数在0.62～0.75，遗传相似系数平均值为0.68。杂交后代株系与母本的遗传相似系数大于其与父本间的，说明杂交后代与母本的亲缘关系更近，表现为偏母性遗传。这与供试的杂交后代株系在聚类过程中与母本的亲缘关系更近的结果相吻合。46 个杂交后代株系间的遗传相似系数为0.64～0.95，遗传相似系数平均值为0.79，高于杂交后代与父母本间的遗传相似系数。

图3 文心兰亲本与杂种间遗传相似系数Fig. 3 Coefficients of genetic similarity between Oncidium parents and hybrid progenies

3 讨论

杂交后代早期鉴定是杂交育种工作中的一个重要环节，快速筛选出真杂种，对提高育种效率、缩短育种周期具有重要意义。分子标记技术因其具有操作方便，不受环境限制等优点，已成功应用于多种植物杂交后代真实性鉴定。李胜男等[20]利用InDel 特异性分子标记对苹果和梨远缘杂种后代进行鉴定；尹跃等[21]利用SSR 分子标记对枸杞种间杂交后代群体进行鉴定；胡凤荣等[22]利用ISSR 分子标记鉴定了风信子3 个杂交组合的杂交后代真实性；刘颖鑫等[23]利用SSR 和SRAP 标记研究了菊花脑与甘菊种间杂种的真实性。本研究利用EST-SSR 标记和SRAP 标记对文心兰杂交后代株系进行了早期鉴定，共筛选出6 对EST-SSR 和10 对SRAP 引物组合用于文心兰杂交后代的真实性鉴定研究中，供试的46 个杂交后代株系均鉴定为真杂种，鉴定效率为100%，说明EST-SSR 和SRAP 分子标记技术应用于文心兰杂交后代真实性鉴定研究中是可行的。

在杂交后代真实性鉴定的过程中，发现在一个引物对或引物组合中未鉴定出真杂种的杂交后代株系在另一个引物对或引物组合中被鉴定出了，说明不同引物对或引物组合所鉴定的结果存在差异，因此，利用互补原理，采用多个引物对或引物组合进行鉴定，效果更好[24]。研究还发现，供试的SRAP 引物组合扩增到的平均父本特征带数较EST-SSR 引物扩增到的多，且平均鉴定效率较EST-SSR 引物高，说明SRAP 标记较EST-SSR 标记在文心兰杂交后代鉴定中更占优势。而在引物多态性比较中，筛选出的EST-SSR 标记引物的多态性条带占比为87.18%，SRAP 引物组合多态性条带占比为81.82%，说明供试的48 个文心兰材料具有较高的遗传多样性，也表明在多态性分析中，EST-SSR 标记较SRAP 标记更有优势。综上所述，2 种标记各有自身优势，故基于2种标记的综合扩增结果进行文心兰杂交后代株系的聚类分析和遗传相似系数分析，结果更为可靠。忻雅等[25]对草莓遗传多样性的研究也证实了，SSR+SRAP联合标记分析能更加全面、有效地揭示草莓种质间的亲缘关系。

聚类分析在一定程度上反映了分析个体的相似性，对文心兰亲本及杂交后代进行聚类分析，可以作为判断后代株系与亲本亲缘关系远近的依据。本研究中，黄金午后与百万金币通过属间杂交，获得了46 个杂交后代株系，供试的杂交后代株系在聚类过程中先与母本黄金午后聚在一起，说明46 个杂交后代株系与母本的亲缘关系更近，这与杂交后代株系与母本的平均遗传相似系数大于父本的分析结果相互印证。在杂交育种过程中，通常认为遗传距离较远的亲本之间杂交更有可能产生丰富变异。本研究中，母本黄金午后与父本百万金币间的遗传相似系数仅为0.36，为文心兰新品种的选育奠定了良好基础。对文心兰亲本与杂交后代的遗传相似系数分析发现，亲本与杂交后代株系间的遗传相似系数在0.51～0.64 和0.62～0.75，说明在供试的杂交后代株系中可能出现了一些差异较大的个体，这为优异中间材料的选育提供了机会。研究还发现，杂交后代株系间的遗传相似系数中位数明显高于亲本间的遗传相似系数，说明该组合杂交后代的遗传基础趋向于变窄，类似的研究结果在菊花[26]和蓝莓[27]中均有报道。因此，在今后文心兰的育种工作中，应通过选择遗传差异较大的品种进行杂交，以尽量提高杂交后代的遗传多样性。

综上，本研究利用6 对EST-SSR 和10 对SRAP引物组合用于文心兰杂交后代的真实性鉴定，鉴定效率达100%，并从分子水平探讨了不同杂交后代株系间及杂交后代株系与亲本间的亲缘关系远近，发现供试的杂交后代株系均表现为偏母性遗传。研究结果表明EST-SSR 和SRAP 分子标记用于文心兰杂交后代群体的真实性鉴定和遗传多样性分析研究中是有效的。本试验结果为文心兰杂交后代真实性的鉴定、种质资源评价提供了技术支撑，鉴定出的真杂种后代加快了文心兰新品种的选育进程，为文心兰新品种选育研究奠定基础。