基于EST-SNP 的福建云霄茶树种质资源遗传多样性分析

王泽涵，于文涛，方德音，蔡捷英，王金焕，樊晓静，刘财国，徐 飙，叶乃兴 *

（1. 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2. 福州海关技术中心，福建 福州 350001；3. 云霄县茶叶科学研究所，福建 云霄 363300；4. 福建省亚热带作物学会，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意义】茶树[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作为重要的经济作物，目前在全球50 多个国家广泛种植[1−2]。中国茶树种质资源丰富，有较高的遗传多样性[3]。茶树遗传多样性是生物多样性的组成部分之一，对一些地区茶树遗传多样性和遗传结构的研究有助于对该地区茶树种质资源的认识和保护[4]。福建省由于独特的地理位置和气候，使得该地区孕育了大量的茶树种质资源[5]。云霄位于福建南部，云霄县地方茶树种质资源丰富，其主要分布在云霄大帽山、小帽山、梁山、乌山等地[6−7]。利用SNP分子标记技术对云霄茶树资源亲缘关系、遗传多样性、群体结构的分析，对该地区地方茶树种质的认识、保护和开发具有重要意义。【前人研究进展】随着分子标记技术的发展，RAPD[7]、AFLP[8]、ISSR[9]、SSR[10]等技术已广泛应用于茶树。SNP 作为第三代分子标记技术，具有自动化、高通量、遗传稳定性高[11]等优点。由于单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms，SNPs）广泛存在于植物基因中，因此目前在植物鉴定中占据相对的优势[12]。SNP 技术在茶树上也得到了有效的利用，如林浥等[13]利用SNP技术对闽北、闽南、粤东、台湾等4 个乌龙茶主产区茶树种质资源组群间的遗传关系进行了分析。陈立杰等[14]采用SNP 技术分析了贵阳花溪茶树资源的遗传多样性。樊晓静等[15]以前期开发的SNP 候选位点为基础，进一步筛选得到最优SNP 位点，结合茶树品种基本信息构建茶树品种资源分子身份证。【本研究切入点】本课题组前期在云霄县发现野生秃房茶树群体种质资源[16]，但其亲缘关系有待深入探讨。【拟解决的关键问题】利用SNP 分子标记技术对云霄县地方茶树种质资源进行亲缘关系的研究，以期在分子水平上分析云霄野生秃房茶树群体种间的遗传关系，为该地区地方种质的利用、开发和选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料共62 份，包括福建云霄县的61 份和云南的南糯山大茶树1 份。南糯山大茶树是来源于茶树起源地中国西南部地区的乔木大叶种[1]，为茶树种质资源演化的基部类群，适于作为置根参照来分析云霄茶树种质资源的亲缘关系。按照取样地，可将云霄的茶树种质资源分为6 组，分别为组别I、II、III、IV、Ⅴ和Ⅵ。组别I 为来源于南乌山的9 份茶树种质，组别II 为来源于乌山的6 份茶树种质，组别III 为来源于小帽山的16 份茶树种质，组别IV 为来源于大帽山的20 份茶树种质，组别Ⅴ为来源于鸡笼山的1 份茶树种质，组别Ⅵ为来源于梁山的9 份茶树种质（表1）。采集后的样品经过液氮固定后置于−80 ℃冰箱保存。

表1 供试云霄茶树种质资源基本信息Table 1 Basic information on tea germplasms in Yunxiao

1.2 样品DNA 的提取

采用新型植物基因组DNA 提取试剂盒(TIANGEN，DP320，北京)提取样品DNA。用超微量紫外分光光度计（Implen，S60716，德国）测定DNA 浓度和纯度。

1.3 SNP 位点的挖掘和选择

本课题组前期从国家生物信息中心（nationalcenter of biotechnology information，NCBI）的数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载了茶树的表达序列标签（express sequence tags，EST），并经过装配、开发、验证，最终筛选出96 个可用于茶树种质资源的SNP 标记位点[13,17]。使用Fluidigm 96.96Dynamic Array™IFC 芯片（Integrated Fluidic Circuit; Fluidigm®Corp，USA）进行基因分型，参照Fluidigm 96.96 SNPtype 基因分型参考书（Fluidigm，PN100-3912）进行试验，并依后续样品情况进行改进。

1.4 数据分析

芯片上机后使用EP1 仪器进行数据的收集。用Fluidigm SNP Genotyping Analysis 软件（https://www.fluidigm.com/software）进行数据导出和分析，随后用GenAlEx6.503 软件[18]分析等位基因频率（allele frequency）、信息指数（information index，I）、观察杂合度（observed heterozygosity，Ho）、预期杂合度（expected heterozygosity，He）、固定指数（fixation index，F）和次等位基因频率（minor allele frequency，MAF）。使用GenAlEx6.503 软件进行遗传距离计算并进行主坐标分析（principal coordinates analysis）。利用MEGA X 软件，用层次聚类的方法构建树状图，使用南糯山大茶树置根。

2 结果与分析

2.1 云霄茶树种质资源的SNP 多态性位点筛选及分析

通过对96 个位点的筛选，获得66 个多态性强、适用于云霄茶树种质基因分型的特异性引物。试验筛选出的66 个SNP 位点及多态性信息见表2。这些SNP 标记多态性信息指数为0.047～0.693，平均值为0.415。观测杂合度为0.016～1.000，平均值为0.309。期望杂合度为0.016～0.500，平均值为0.260。固定指数为−1.000～0.658，平均值为−0.072。次等位基因频率为0.050～0.500，平均值为0.197。观测杂合度平均值和期望杂合度平均值接近，说明云霄茶树资源遗传多样性丰富。此外，引物筛选时，确保次等位基因频率MAF≥0.05。本研究引物的次等位基因频率图如图1 所示。云霄茶树资源的部分引物分型效果如图2，从图中可以看出本研究所选的位点分型效果良好，供试样品在每一个引物中都得到了很好区分，而且所选引物多态性强，每个都包含有3 种基因型（XX、YY 和XY）。

图1 云霄茶树资源66 个SNP 位点的次等位基因频率Fig. 1 Minor allelic frequencies of 66 SNP loci in Yunxiao tea germplasms

图2 云霄茶树资源部分引物的分簇效果Fig. 2 Clustering of primers in Yunxiao tea germplasms

表2 云霄茶树资源的66 个茶树SNP 位点多态信息Table 2 Allele information of 66 polymorphic SNP markers in Yunxiao tea germplasms

2.2 云霄茶树种质资源SNP 基因图谱的构建

DNA 指纹图谱是指DNA 样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA 片段的总称，其可以鉴别品种间的差异，有高度的个体特异性和环境稳定性，具有良好的应用前景。本研究通过Fluidigm SNP Genotyping Analysis 软件，可以确定每个SNP 位点上每个样品的基因型，即XX 型、XY 型和YY 型3 种。其中XX 型和YY 型为纯合子，包括AA，TT，CC，GG等4 种等位基因；XY 型为杂合子，包括TC，AG，CT，GA，AT，GC，GT，CG，AC，TG，CA，TA等12 种等位基因。其中A、G、T、C 分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。本研究通过66 个高质量SNP 位点分型，构建了云霄茶树及其他相关种质资EST 指纹图谱（图3）。

图3 云霄茶树种质资源的EST-SNP 指纹图谱Fig. 3 EST-SNP fingerprints of Yunxiao tea germplasms

2.3 云霄茶树种质资源遗传关系

云霄茶种质资源遗传关系如图4 所示。根据PCoA分析结果，第一主成分、第二主成分和第三主成分的贡献率分别为29.29%、11.21%、9.57%。从图中可以明显看出，云霄地方茶树种质资源聚集在一起，各组皆存在交流现象。从组内集中程度来看，乌山、大帽山和南乌山组内分布相对集中；而小帽山和梁山分布相对分散，其中梁山组群中的梁山大茶树1 号、梁山大茶树2 号和梁山7 号与其他茶树距离较远。此外，小帽山的茶树种质分布相对独立于其他组群。

图4 62 份茶树种质资源的主坐标分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of 62 tea germplasms

2.4 云霄茶树种质资源群体的遗传距离

用GenAlEx6.503 软件计算6 个种群间的遗传距离如图3。群体间的遗传距离为0.150～0.926，其中云霄南乌山云霄梁山的茶树群体遗传距离最近，为0.926；大帽山和鸡笼山种质遗传距离最远，为0.150（表3）。

表3 云霄茶树种质资源群体间遗传距离Table 3 Genetic distance between populations of Yunxiao tea germplasms

2.5 云霄茶树种质资源的聚类分析

中国西南部地区是茶树的起源地，南糯山大茶树为采自云南的古老大乔木种，其为茶树种质资源演化过程中的基部类群，以其置根进行聚类分析可以更科学地反映出云霄茶树种质之间的遗传关系。本研究利用MEGA 软件，构建云霄地方茶树种质间的遗传关系聚类图（图5）。从图中可以看出小帽山组群与大帽山组群的亲缘关系相对最远；各组组群内的茶树种质大多在同一分支或相邻的几个分支，如小帽山组群、梁山组群等；同时不同组群之间也有基因交流，如乌山5 号、梁山大茶树2 号、梁山3 号、乌山1 号、乌山6 号、梁山1 号、梁山4 号和南乌山8 号等分布在大帽山组群分支上。该聚类分析结果同PCoA 结果一致。从图中还可以看出，小帽山组群的分支相对其他组最多，与其他5 个组群的交流也相对较少。

图5 云霄茶树种质资源的聚类分析Fig. 5 Clustering of Yunxiao tea germplasms

3 讨论与结论

3.1 云霄茶树种质资源的遗传多样性丰富

植物基因组中SNP 出现的频率较高，使得SNP 技术在植物的遗传多样性分析上更有优势[13]。同一区域内的茶树资源，其遗传相似性相对较高，这要求DNA 标记采用的引物分型效果好，多态性强[19]。本研究利用SNP 分子标记技术，对云霄茶树资源进行基因分型，从96 个SNP 引物中筛选出66 个适用于云霄茶树种质遗传关系分析的SNP 位点。茶树本身具有高度的杂合性，加之其又是异花授粉，在长期杂交演化过程中产生大量不连续变异[20]。观测杂合度值和期望杂合度值越接近，群体的遗传多样性程度越高[21]。在本研究中，62 份茶树的观测杂合度平均值为0.309，期望杂合度平均值为0.260，说明供试的云霄茶树样品具有较高的遗传多样性。

3.2 云霄茶树种质资源的DNA 指纹图谱

当前，对DNA 指纹图谱的应用已逐渐广泛，如彭丁文等[22]用SSR 标记构建了中国南方应用面积较大的部分籼型两系不育系水稻的指纹图谱。陈亮等[23]通过16 个RAPD 对24 份云南等地野生茶树进行了鉴定。樊晓静[19]采用SNP 标记，构建了闽东茶树种质的DNA 指纹图谱。云霄县的野生秃房茶树资源丰富[7]，本研究以SNP 分子标记技术为支持，筛选66 个SNP 位点，对61 份云霄茶树种质构建了DNA 指纹图谱，可以用于云霄茶树种质资源的精准鉴定。

3.3 云霄茶树种质资源的研究展望

通过对云霄茶树种质资源进行主坐标分析和聚类分析可以发现，云霄6 个组群的茶树种质资源各自相对独立，同时又存在基因交流现象。各个组群内分布相对集中，组群间又相互交流，该分析结果与李浩宇等[24]的研究结果相似，说明云霄茶树种质资源的遗传多样性丰富。值得注意的是，小帽山组群内部茶树资源分布广泛，表明该组群遗传多样性更为丰富。由于不同群体的茶树种质资源相对独立，在云霄地方茶树种质资源的收集、保护和创新研究过程中，应进一步扩大收集云霄县不同区域范围的茶树种质资源，深入开展云霄县优特茶树种质资源的鉴定评价研究工作。