吉林克雷伯氏菌2N3对噻吩磺隆的降解特性及其土壤修复作用

林 杨，潘泽群，张金鹏，张 浩

(吉林农业大学 植物与保护学院，吉林 长春 130118)

噻吩磺隆(thifensulfuron-methyl)，学名为3-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-(2-甲氧基甲酰基噻吩-3-基)-磺酰脲[1-2],是一种高效、低毒、内吸传导型选择性除草剂[3-5]，主要用于小麦田、玉米田等大多数阔叶性杂草的防除, 对禾本科杂草也有一定的抑制效果[6-8]。噻吩磺隆的广泛应用在提高农业生产效率方面发挥了重要作用，但其残留给环境、农产品及人类健康带来了诸多危害。此外，噻吩磺隆及其代谢物不仅会对敏感农作物产生药害，亦会对其他作物产生危害，有时甚至会严重影响作物的正常生长[9-10]。

微生物降解是目前最安全有效的农药降解方式[11]，国内外学者已报道磺酰脲类除草剂的主要降解菌有HansschlegeliazhihuaiaeS113[12]、ChenggangzhangellamethanolivoransCHL1[13]、寡养单胞属(Stenotrophomonassp．)[14]、芽孢杆菌属(Bacillussp．)[15]、假单胞属(Pseudomonassp．)[16]、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)[17]、葡萄球菌属(Staphylococcussp．)[18]和苍白杆菌属(Ochro-bactrumsp．)[19]等。此外，Hang等[12]从HansschlegeliazhihuaiaeS113中克隆了一个新的水解酶基因SulE，其主要负责磺酰脲类除草剂的去酯化反应。由于不同微生物对磺酰脲类除草剂的降解途径不同，以致于产生的中间降解产物也有一定的差别[20]。目前报道的磺酰脲类除草剂在环境中的降解代谢方式有磺酰脲桥断裂、皂化反应、脱甲基作用、脱酯反应等[21-22]，其中磺酰脲桥断裂是磺酰脲类除草剂的主要降解代谢途径，随之生成的降解产物为相应的磺酰胺和杂环胺[23]。本试验以吉林农业大学农药学实验室分离的磺酰脲类除草剂的降解菌吉林克雷伯氏菌(Klebsiellajilinsis)2N3菌株[24-25]为研究对象，对其降解特性及对噻吩磺隆污染土壤的生物修复作用进行研究，以期为该菌在噻吩磺隆污染土壤修复中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 吉林克雷伯氏菌(Klebsiellajilinsis) 2N3菌株，由吉林农业大学农药学实验室分离纯化，冷冻保存。

1.1.2 供试土壤 供试土壤采自吉林省长春市玉米田，土壤类型为草甸黑土，其pH为6.57，有机质含量2.65 g/kg。采集耕层(0～20 cm)新鲜土样自然风干，过孔径425 μm筛后备用。

1.1.3 药品及试剂 噻吩磺隆原药(有效成分97%)，由江苏瑞邦农药厂有限公司提供；乙腈(色谱纯)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；乙酸、氯化钠、葡萄糖、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7 H2O，均购自北京北化精细化学品有限责任公司；酵母浸粉、胰蛋白胨、琼脂，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.4 仪器设备 Agilent1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；UV-2550紫外分光光度计，岛津仪器苏州有限公司；HZQ-F100振荡培养箱，常州诺基仪器有限公司；DSX-280B压力灭菌锅，河南仪器仪表设备有限公司；GL-16LX立式高速冷冻离心机，苏州欧倍科学仪器有限公司；SW-CJ-IF型超净工作台，郑州南北仪器设备有限公司；KQ-250DE医用数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；WMK-02电热恒温培养箱，南京实验仪器厂。

1.1.5 培养基 供试培养基有LB液体培养基、LB固体培养基和无机盐培养基，培养基组成参照文献[25]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种制备 将2N3单菌落接种于LB液体培养基中，30 ℃、150 r/min恒温振荡培养12 h，7 000 r/min离心5 min，弃去上层清液，用磷酸缓冲液洗涤3次，最后再用磷酸缓冲液重悬备用。

1.2.2 2N3在无机盐培养基中的降解特性 试验的基本条件为：无机盐培养基pH 7.0，摇床温度30 ℃，2N3接菌量5%(以体积分数表示)，NaCl体积分数0.3%，将溶于乙腈的噻吩磺隆溶液添加到无机盐培养基中，使其质量浓度为50 mg/L，150 r/min摇床振荡培养24 h。分别通过改变基本条件中的噻吩磺隆初始质量浓度(5，10，30，40，50 mg/L)、2N3接菌量(以体积分数表示，分别为1%，3%，5%，7%，9%)、培养温度(15，25，30，35，40 ℃)、pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、NaCl体积分数(0，0.1%，0.3%，0.7%，1.0%)，在其他条件保持不变的情况进行试验，培养10和24 h后，利用紫外分光光度计测定其在波长600 nm时的吸光度，即为2N3的生长情况，并测定噻吩磺隆的质量浓度。每处理重复3次，以未接2N3的无机盐培养基为对照。

1.2.3 土壤中噻吩磺隆的降解 取供试未灭菌土壤500 g，加入溶于乙腈的噻吩磺隆药液，充分拌匀，使土壤中噻吩磺隆的质量浓度为50 mg/L，以菌体浓度0.5×1012CFU/g接入2N3菌悬液，用无菌水调整含水量为20%，混匀备用。同时设置湿热灭菌土壤处理，并设添加噻吩磺隆药液但不添加2N3菌悬液的土壤作为空白对照，每处理重复3次。

将各处理放在生化培养箱中，于25 ℃黑暗条件下培养，定期称质量并补足水分。在培养开始后2 h及1，3，5，7，14，20 d，取样测定土壤中的噻吩磺隆残留量。

1.2.4 无机盐培养基和土壤中残留噻吩磺隆的提取与测定 (1)无机盐培养基中残留噻吩磺隆的提取。取20 mL无机盐培养液，7 000 r/min离心5 min，取上清液10 mL于250 mL分液漏斗中，分别用20，25，25 mL二氯甲烷萃取噻吩磺隆，合并有机相过无水硫酸钠，收集液体，40 ℃旋转浓缩至近干，乙腈定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，用HPLC测定。

(2)土壤中残留噻吩磺隆的提取。称取土壤样品20 g于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL乙腈和10 mL水，恒温振荡提取40 min，然后真空抽滤，滤液转入100 mL具塞量筒中，再向该量筒中加入8 g氯化钠，上下振荡100次静止1 min，再振荡150次静止1 h，取上层25 mL乙腈溶液，减压浓缩至近干，乙腈定容至2 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，用HPLC测定。

噻吩磺隆降解率的计算公式为：

(3)液相色谱仪测定条件。Agilent1260高效液相色谱仪，色谱柱Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm) ；流动相为乙腈和0.1%乙酸水溶液(V(乙酸)∶V(水)=35∶65)，流速0.8 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样体积10 μL。

2 结果与分析

2.1 HPLC方法的灵敏度、准确度和精确度

为了考察HPLC方法的准确度，分别在空白土壤样品和无机盐溶液中添加一定量噻吩磺隆标准溶液，使其质量浓度分别为0.1，0.5，1.0 mg/L，每处理5次重复，进行添加回收试验。结果测得空白土壤样品中噻吩磺隆的添加回收率分别为86.9%～97.2%，95.7%～99.6%，85.7%～94.9%；空白无机盐溶液中噻吩磺隆的添加回收率分别为87.6%～98.2%，92.6%～98.9%，89.3%～96.4%。在该条件下，噻吩磺隆最小检出量为5×10-10g，最低检出限为0.05 mg/L，可有效进行噻吩磺隆的定性和定量分析。添加回收试验结果表明，本研究所采用的噻吩磺隆残留分析方法，准确度、灵敏度与精密度均符合农药残留检测的要求[26-27]。

2.2 2N3在无机盐培养基中的降解特性

2.2.1 噻吩磺隆初始质量浓度对2N3降解噻吩磺隆的影响 在含不同初始质量浓度噻吩磺隆的无机盐培养基中，接种2N3后于150 r/min振荡培养10和24 h，分析其对噻吩磺隆的降解作用，结果见图1。

由图1可知，2N3对高质量浓度噻吩磺隆的降解效果较好，当无机盐培养基中噻吩磺隆的初始质量浓度分别为5，10，30，40，50 mg/L时，接种相同量2N3菌悬液，在30 ℃、150 r/min振荡培养24 h后，噻吩磺隆的降解率分别为63.48%，76.11%，80.44%，85.94%和90.41%。这说明无机盐培养基中噻吩磺隆的初始质量浓度越高，2N3菌株对其的 降解效果越好，在噻吩磺隆初始质量浓度较低时降解率却较低，这是因为2N3以噻吩磺隆为唯一氮源，较高质量浓度的噻吩磺隆有利于2N3菌体的生长。

2.2.2 2N3接菌量对噻吩磺隆降解的影响 由图2可知，在噻吩磺隆初始质量浓度为50 mg/L的无机盐培养基中，接种2N3菌悬液使其接菌量(体积分数)分别为1%，3%，5%，7%，9%时，培养24 h后噻吩磺隆的降解率依次为73.38%，77.49%，90.41%，98.34%和98.43%。由此可知，无机盐培养基中噻吩磺隆的降解率与2N3接菌量呈正相关关系。当无机盐培养基中2N3接菌量为7%和9%时，经24 h培养降解后无机盐中的噻吩磺隆质量浓度最低，分别为 0.749和0.739 mg/L。

2.2.3 培养温度对2N3降解噻吩磺隆的影响 由图3可知，30 ℃培养10 h时，2N3对噻吩磺隆的降解率均高于其他温度处理。培养24 h时，以温度为25～35 ℃时2N3的降解效果较好，尤其以30 ℃时的降解率最高，可达90.41%；而在15和40 ℃时，2N3对噻吩磺隆的降解率仅分别为31.88%和61.27%。表明2N3降解噻吩磺隆的最适温度为25～35 ℃，最佳降解温度为30 ℃。

图2 2N3接菌量对菌株生长及噻吩磺隆降解的影响

2.2.4 pH对2N3降解噻吩磺隆的影响 由图4可知，在噻吩磺隆质量浓度为50 mg/L的无机盐培养基中，接种2N3菌悬液并使基础盐的pH分别为5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，培养24 h后2N3对噻吩磺隆的降解率分别为32.62%，77.19%，90.41%，75.66%和36.59%。当pH为7.0时，培养10和24 h后的降解率分别为48.05%和90.41%。由图4还可知，菌株2N3的生长与其对噻吩磺隆的降解效率呈正相关。在pH为6.0～8.0时2N3的降解效果较高，表明2N3对噻吩磺隆进行生物降解时的pH范围较宽。

图4 2N3在不同pH条件下的生长及其对噻吩磺隆的降解作用

2.2.5 NaCl体积分数对2N3降解噻吩磺隆的影响 在含不同体积分数NaCl的无机盐培养基中，2N3的生长情况及其对噻吩磺隆的降解效果如图5所示。由图5可知，在噻吩磺隆质量浓度为50 mg/L的无机盐中，接种2N3菌悬液并使无机盐中的NaCl体积分数为0%，0.1%，0.3%，0.7%和1.0%，培养24 h后2N3对噻吩磺隆的降解率分别为76.17%，84.91%，90.41%，78.32%和59.01%。当无机盐中的NaCl体积分数为0.3%时，经24 h培养降解后无机盐中的噻吩磺隆质量浓度最低。当NaCl体积分数从0.3%升高至1.0%时，菌株2N3的生长受到了一定的抑制，OD600显著降低，噻吩磺隆的降解率也有所下降。

2.3 2N3对土壤中噻吩磺隆的降解效果

从图6可以看出，在噻吩磺隆质量浓度为50 mg/L条件下，灭菌但不加2N3菌悬液的土壤，培养20 d后噻吩磺隆的降解率为39.23%；灭菌且加2N3菌悬液的土壤，培养20 d后噻吩磺隆的降解率为87.37%，这说明加入降解菌2N3后可以大幅加速噻吩磺隆的降解。

图6 2N3对土壤中噻吩磺隆的降解效果

而对未灭菌且不加2N3菌悬液的土壤而言，培养20 d后噻吩磺隆降解率为64.02%；未灭菌且加2N3菌悬液的土壤，20 d后噻吩磺隆的降解率为96.03%。由此可以看出，接入外源降解菌2N3可提高土壤中噻吩磺隆的降解速率，且无论是否加入外源微生物，未灭菌土壤中噻吩磺隆的降解速率始终较灭菌土壤快。这与李晓楼等[17]的研究结果一致。可能是因为未灭菌土壤中含有大量微生物，这些微生物也参与了噻吩磺隆的降解[28-31]，土壤微生物与降解菌2N3以协同作用的方式降解噻吩磺隆，从而提高了土壤中噻吩磺隆的降解率。

3 结 论

1)吉林克雷伯氏菌2N3菌株能以噻吩磺隆为唯一氮源进行生长。2N3降解噻吩磺隆的最优条件为：噻吩磺隆初始质量浓度为50 mg/L，pH 7.0，2N3接菌量为5%(体积分数)，降解温度30 ℃，NaCl体积分数为0.3%。

2)吉林克雷伯氏菌2N3菌株对土壤中的噻吩磺隆具有较好的降解能力，最高降解率可达96.03%。无论是灭菌土壤还是未灭菌土壤，加入2N3均可以加速噻吩磺隆的降解，并且未灭菌土壤中噻吩磺隆的降解率高于灭菌土壤。