循环lnc-NEAT1/miR-124轴与哮喘患儿急性发作风险、疾病严重程度和炎症的关联分析

廖伟荣，叶卫平

(台州市中医院 儿科，台州 318000)

哮喘是由于细支气管平滑肌痉挛及不同程度的黏膜水肿、分泌亢进引起的过敏性疾病，也是儿童最常见的慢性气道炎症性疾病[1-2]。目前，儿童哮喘总体控制水平仍不理想，故探索与儿童哮喘发生和发展相关的标志物具有深远意义[1]。近年来发现，长链非编码RNA核富集转录体1(long non-coding RNA nuclear enriched abundant transcript 1， lnc-NEAT1)在脓毒症和SLE等疾病中发挥着重要作用[3-6]，miR-124在脓毒症和急性肺损伤小鼠模型中可降低炎症水平[3，7-9]。鉴于lnc-NEAT1和miR-124均在炎症性疾病及肺部疾病中发挥重要作用，且miR-124是lnc-NEAT1的靶向基因之一[7-9]，推测lnc-NEAT1可能通过调节miR-124参与儿童哮喘的发生、发展过程，但目前尚未见相关报道。本研究旨在评估lnc-NEAT1/miR-124轴对儿童哮喘急性发作风险的预测作用，并探索其与疾病严重程度及炎症的关联。

1 资料与方法

1.1 研究对象本研究连续纳入2016年3月至2018年2月台州市中医院收治的急性发作期哮喘患儿95例(轻度25例、中度52例、重度18例)、缓解期哮喘患儿95例。所有入组哮喘患儿均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[10]的诊断标准，且年龄均<16岁。急性发作期定义为突然发生喘息、咳嗽、气促、胸闷等症状或原有症状急剧加重；缓解期定义为经过治疗或未经治疗症状、体征消失，肺功能恢复到急性发作前水平，并维持3个月以上。在急性发作期和缓解期哮喘患儿中有合并严重感染、血液系统疾病或恶性肿瘤者予以排除。同期纳入90例在台州市中医院进行健康体检且体检指标无异常的儿童作为健康对照。健康对照儿童入组需满足：年龄、性别等基本人口学资料与哮喘患儿匹配，无哮喘及其他过敏性疾病史，无感染、血液系统疾病或恶性肿瘤。3组受试者的年龄、性别、身高、体质量、家族哮喘病史等差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。本研究经台州市中医院伦理委员会批准，所有受试者及其法定监护人在研究开始前均已签署知情同意书。

表1 研究对象的一般资料

1.2 肺通气功能检测及疾病严重程度评估哮喘患儿于入院或门诊当日进行肺部通气功能检测，健康儿童于体检时进行肺部通气功能检测。肺部通气功能检测包括第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)和用力肺活量(forced vital capacity，FVC)，并分别计算FEV1与FVC之比(FEV1/FVC)及FEV1与正常预计值之比(FEV1%预计值)。同时，根据哮喘急性发作时的症状、体征、肺功能及血氧饱和度等情况，参考《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[10]评估急性发作期哮喘患儿疾病的严重程度。

1.3 血液样本采集与处理所有受试者入组后采集外周静脉血于抗凝管中，并在收集后1 h内离心分离血浆。离心分离条件：样本在4 ℃以1 600×g离心10 min，吸取上清液，再在4 ℃以16 000×g离心10 min，分离得到血浆。将血浆样本转移至冻存管中，—80 ℃保存，待后续检测。血浆样本中lnc-NEAT1和miR-124的相对表达量采用实时荧光定量PCR检测，炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17)采用ELISA检测。

1.4 ELISA检测采用ELISA试剂盒(Abcam公司)按照操作说明进行检测。简要流程：首先向预包被抗体的96孔板中加入样本，孵育，然后用封闭液进行封闭，再加入第2个抗体稀释液进行孵育。经四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)显色后，用酶标仪(Biotek公司)在450 nm处读数。

1.5 实时荧光定量PCR检测采用TRIzol(Invitrogen公司)从血浆中提取总RNA，然后用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒(Bio-Rad公司)将总RNA反转录为cDNA，再用THUNDERBIRD®SYBR®qPCR Mix试剂盒(Toyobo公司)完成实时荧光定量PCR检测。以GAPDH和U6分别作为lnc-NEAT1和miR-124的参照物，采用2-△△Ct法计算lnc-NEAT1和miR-124的相对表达量。(表2)

表2 实时荧光定量PCR的引物序列

2 结果

2.1 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴在急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿和健康儿童中的表达水平及ROC曲线与健康儿童比较，lnc-NEAT1及lnc-NEAT1/miR-124轴在急性发作期哮喘患儿和缓解期哮喘患儿中均呈现较高的表达(P<0.05)，且在急性发作期哮喘患儿中的表达高于缓解期哮喘患儿(P<0.001)。ROC曲线显示，lnc-NEAT1、miR-124及lnc-NEAT1/miR-124轴可以很好地区分急性发作期哮喘患儿与健康儿童以及急性发作期哮喘患儿与缓解期哮喘患儿，且与单独的lnc-NEAT1或miR-124比较，lnc-NEAT1/miR-124轴具有更强的预测价值。(图1)

注：CI为可信区间(confidence interval)。图1 lnc-NEAT1、miR-124、lnc-NEAT1/miR-124轴在3组受试者中的水平比较及ROC曲线分析

2.2 lnc-NEAT1表达量与miR-124表达量在急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿和健康儿童中的关联lnc-NEAT1表达量与miR-124表达量在急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿和健康儿童中均呈负相关(r=-0.338，P=0.001；r=-0.290，P=0.004；r=-0.316，P=0.002)。

2.3 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与嗜酸性粒细胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1%预计值在急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿和健康儿童中的关联急性发作期哮喘患儿的lnc-NEAT1表达量与FEV1/FVC和FEV1%预计值均呈负相关(r=-0.288，P=0.005；r=-0.296，P=0.004)。急性发作期哮喘患儿的miR-124表达量与FEV1/FVC和FEV1%预计值均呈正相关(r=0.473，P<0.001；r=0.469，P<0.001)，而在健康儿童中，miR-124表达量与FEV1/FVC呈正相关(r=0.240，P=0.023)。此外，急性发作期哮喘患儿的lnc-NEAT1/miR-124轴表达量与FEV1/FVC和FEV1%预计值均呈负相关(r=-0.495，P<0.001；r=-0.465，P<0.001)。(表3)

2.4 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与炎性因子在急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿和健康儿童中的关联急性发作期哮喘患儿及缓解期哮喘患儿的lnc-NEAT1表达量与TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈正相关(P<0.05)，健康儿童的lnc-NEAT1表达量与TNF-α、IL-6和IL-17水平呈正相关(P<0.05)。急性发作期哮喘患儿的miR-124表达量与TNF-α和IL-1β水平呈负相关(P<0.05)，健康儿童的miR-124表达量与TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈负相关(P<0.05)。急性发作期哮喘患儿、缓解期哮喘患儿及健康儿童的lnc-NEAT1/miR-124轴表达量与TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平均呈正相关(P<0.05)。(表4)

表3 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与嗜酸性粒细胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1%预计值的关联[r值(P值)]

表4 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与炎性因子的关联[r值(P值)]

2.5 lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与急性发作期哮喘患儿疾病严重程度的关联将急性发作期哮喘患儿按照疾病严重程度分为轻度、中度和重度。结果显示，lnc-NEAT1高表达与较重的急性发作期哮喘有关联，而miR-124高表达与较轻的急性发作期哮喘有关联，lnc-NEAT1/miR-124轴高表达与较重的急性发作期哮喘有关联。(表5)

表5 急性发作期哮喘患儿lnc-NEAT1、miR-124和lnc-NEAT1/miR-124轴与疾病严重程度的关联[M (P25～P75)]

3 讨论

lnc-NEAT1可参与多种生物学过程，尤其是炎症性疾病的病理机制[11-12]。有研究发现，lnc-NEAT1在慢性压迫性损伤小鼠模型的脊髓中过表达，且其下调可降低炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平[11]。lnc-NEAT1对一些炎症性疾病(如SLE及脓毒症)的发生有预测价值[5-6]，然而关于lnc-NEAT1在肺部炎症性疾病中的临床研究报道较少。有一篇研究表明，lnc-NEAT1在有吸烟史的慢性阻塞性肺疾病患者中表达量相比无吸烟史的慢性阻塞性肺疾病患者高[13]。鉴于lnc-NEAT1在多种炎症性疾病及肺部疾病中均发挥重要作用，推测lnc-NEAT1可能也影响哮喘患儿的疾病严重程度或炎症水平，然而尚未见有关报道。本研究纳入了急性发作期哮喘患儿和缓解期哮喘患儿各95例以及健康对照儿童90例，检测其外周血样本中的lnc-NEAT1表达水平，结果显示，lnc-NEAT1在急性发作期哮喘患儿中的表达量明显高于健康儿童和缓解期哮喘患儿，且ROC曲线表明lnc-NEAT1可以很好地预测儿童哮喘急性发作的风险，这可能是由于lnc-NEAT1促进了炎症级联反应，从而致使内膜发生病理性变化，进而导致哮喘的发生[12]。此外，以往研究中尚未见关于lnc-NEAT1与儿童哮喘严重程度和炎症水平的报道[5-6]。本研究结果显示，急性发作期哮喘患儿lnc-NEAT1表达量与肺通气功能呈负相关而与疾病严重程度呈正相关，且在急性发作期哮喘及缓解期哮喘患儿中，lnc-NEAT1表达量与炎性因子水平呈正相关。可能的原因是：(1)lnc-NEAT1促进了炎性因子的释放和过多的黏液分泌，加重了气流阻塞，因此影响了FEV1/FVC、FEV1%预计值及疾病严重程度[4，14]；(2)lnc-NEAT1通过增加活性氧而造成免疫系统过度激活的状态，从而提高炎性因子水平[15]。

miRNA已被证实参与了生物体的生长、发育和疾病发生等重要过程[16-17]。其中，miR-124对多种疾病(包括肺部疾病)的炎症反应起到抑制作用[7，18]。如miR-124在脓毒症小鼠模型中降低了血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平，亦在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中减弱炎症反应[7，18-19]。然而关于miR-124在儿童哮喘中的作用尚不明确。本研究结果显示，miR-124对儿童哮喘急性发作的风险有较高的预测价值，急性发作期哮喘患儿miR-124表达量与肺部通气功能呈正相关而与疾病严重程度呈负相关，且在急性发作期哮喘及缓解期哮喘患儿，miR-124表达量与炎性因子水平呈负相关。

考虑到lnc-NEAT1与多种炎症性疾病的发生、发展有关，而miR-124对多种疾病尤其是肺损伤的炎症反应起到抑制作用，此外miR-124是受lnc-NEAT1调节的基因之一，猜测lnc-NEAT1可能通过调节miR-124而影响儿童哮喘的发生、发展，严重程度和炎性因子水平[7-9]。然而，关于lnc-NEAT1和miR-124在儿童哮喘中的作用尚未见报道。本研究评估了lnc-NEAT1与miR-124表达量的关联，并且进一步评价了lnc-NEAT1/miR-124轴在急性发作期和缓解期哮喘患儿中与疾病发生、严重程度及炎性因子的关系。结果显示，lnc-NEAT1与miR-124呈负相关，且lnc-NEAT1/miR-124轴可以很好地预测儿童哮喘急性发作的风险，其高表达与急性发作期哮喘患儿的弱肺部通气功能、高疾病严重程度和高炎性因子水平相关，也与缓解期哮喘患儿的高炎性因子水平相关。同时，lnc-NEAT1/miR-124轴相比lnc-NEAT1或miR-124在数值上具有更大的预测儿童哮喘急性发作风险的价值。以上结果说明，lnc-NEAT1/miR-124轴可以作为一项标志物来预测儿童哮喘急性发作的风险，监测疾病严重程度。

本研究仍有不足之处：(1)仅纳入急性发作期哮喘患儿95例、缓解期哮喘患儿95例以及健康对照儿童90例，各组样本量相对较小，这可能会导致统计效能较低；(2)本研究为单中心研究，研究结果可能缺乏广泛的代表性；(3)lnc-NEAT1在儿童哮喘发生和发展中的分子机制以及lnc-NEAT1/miR-124轴的具体作用尚不明确。因此，非常有必要开展更大样本量的和多中心的研究来验证本研究的结果。同时，有必要进一步探索lnc-NEAT1/miR-124轴在儿童哮喘中的作用机制。

综上所述，循环lnc-NEAT1/miR-124轴在哮喘患儿中呈高表达，可预测儿童哮喘急性发作的风险，且其高表达与急性发作期哮喘患儿的肺部通气功能呈负相关，与疾病严重程度和炎症水平呈正相关，表明lnc-NEAT1/miR-124轴可作为预测儿童哮喘急性发作风险和监测疾病严重程度的潜在标志物。