黄芪甲苷对过敏性鼻炎小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响

田滢，张飞，段传新

(湖北省妇幼保健院 耳鼻喉科，武汉 430069)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，亦称为变应性鼻炎，是一种由IgE介导的Ⅰ型超敏反应疾病，临床表现为打喷嚏、鼻痒、鼻塞、流涕等症状，可导致患者生活质量严重下降[1-3]。全球受AR影响的人约占40%，其在我国11个主要城市中的患病率为8.7%～24.1%，而且发病率近年来呈上升趋势[4-5]。目前，治疗AR的主要临床药物为皮质类固醇及抗组胺药，但无法避免激素抵抗、嗜睡等副作用[6-8]，疗效不甚理想。AR，又称“鼻鼽”，主要由于肺气虚弱，卫阳不固，风邪趁虚而入所致。我国传统医学在千百年的临床实践中对于鼻鼽的治疗积累了丰富的经验。黄芪，性甘温，归肺、脾、肝经，具有增强机体免疫力、抑炎、抗应激等作用，黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ)是黄芪的主要活性成分之一，研究表明，黄芪甲苷具有抑炎、抗纤维化和免疫调节等药理作用[9-10]，是常用中成药通窍鼻炎片中的主要药用成分。近年来研究发现，在AR小鼠模型鼻黏膜组织中高迁移率族蛋白B1(high mobi-lity group box 1 protein，HMGB1)和TLR4蛋白表达水平升高，而抑制HMGB1/TLR4途径可减轻小鼠AR症状[11]。黄芪甲苷对TLR4/NF-κB信号通路具有较好的抑制效果[12]，但其对AR中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响却鲜有报道。因此，本研究通过使用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)构建AR小鼠模型，观察黄芪甲苷对AR小鼠的治疗效果，同时检测AR小鼠体内HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路变化，旨在探讨黄芪甲苷对AR小鼠的疗效及其免疫机制。

1 材料与方法

1.1 动物20只SPF级C57BL/6小鼠，4～6周龄，体质量16～20 g，购自湖北省实验动物研究中心，于华联科生物技术有限公司模型动物研究院饲养。

1.2 材料黄芪甲苷、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；OVA、氢氧化铝[Al(OH)3]，购自Sigma-Aldrich公司；苏木精、伊红染液，中性树脂，小鼠IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IgE、TNF-α、细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)ELISA试剂盒，兔抗HMGB1抗体，兔抗TLR4抗体和兔抗GAPDH抗体，购自武汉华联科生物技术有限公司；PVDF膜和化学发光试剂，购自Millipore公司；兔抗NF-κB p65抗体及兔抗p-NF-κB p65抗体，购自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 AR小鼠模型的构建[13]将20只C57BL/6小鼠随机分为5组：正常组，模型组，黄芪甲苷低、中、高剂量组，每组4只。除正常组外，其他4组小鼠均采用OVA诱导AR模型。造模前14 d进行基础致敏，采用50 μg OVA+5 mg Al(OH)3+1 mL生理盐水混合液腹腔注射小鼠，隔天1次。第15天给予5% OVA溶液双侧鼻腔点鼻，每侧20 μL，1次/ d，连续激发7 d。同期正常组小鼠使用等量的生理盐水处理。

1.3.2 模型评分 在最后一次OVA滴注15 min后，记录小鼠抓鼻、打喷嚏等症状发生情况；根据已有报道[14]，采用叠加法记录总分，总分>5则为造模成功。(表1)

表1 AR小鼠造模评分标准

1.3.3 给药处理 黄芪甲苷低、中、高剂量组分别按照12.5、25.0和50.0 mg/kg的剂量于造模成功后第2天进行灌胃给药处理，正常组和模型组小鼠给予等量的1% CMC-Na灌胃，连续给药27 d。

1.3.4 样本采集 药物干预结束后，于小鼠颈动脉取血，离心后分离血清用于ELISA检测。所有小鼠处死后，从鼻腔中迅速剥离鼻黏膜组织，将其分为2份，一份用于观察病理变化，另一份提取蛋白用于分子检测。

1.3.5 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色 取适量鼻黏膜组织进行脱水浸蜡处理，切成厚度为4～5 μm的切片，乙醇脱蜡，二甲苯透明，HE染色；脱水透明后，中性树脂封片。将染色后的切片置于显微镜下观察其组织形态及炎症细胞浸润情况。

1.3.6 ELISA检测 实验操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行，采用双抗体夹心法测定小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IgE、TGF-β1、ICAM-1和VCAM-1的浓度。

1.3.7 Western blotting检测 剪碎鼻黏膜组织，将20 mg组织加入200 μL裂解液中，匀浆直至完全裂解。裂解后，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液。采用BCA法测定蛋白质浓度，取20 μg样本进行SDS-PAGE。湿转法将目的蛋白转印至PVDF膜上，并用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h。加入稀释后的一抗(HMGB1，1∶1 000；TLR4，1∶1 000；NF-κB，1∶1 000；p-NF-κB，1∶5 000)，室温孵育1 h后，PBST漂洗3次。加入抗IgG-HRP二抗，室温孵育1 h，PBST漂洗3次。加入化学发光试剂，充分作用后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对小鼠鼻部症状的影响正常组小鼠基本无抓鼻、打喷嚏、流涕症状，而模型组小鼠出现频繁抓鼻，鼻头红肿甚至轻微出血，流清水涕的症状，评分为6.25±0.50，提示实验造模成功。经过黄芪甲苷治疗后，小鼠症状得到缓解，低剂量组的评分为4.00±1.15，中剂量组为3.00±0.00，高剂量组为1.00±0.00。

2.2 黄芪甲苷对鼻黏膜病理变化的影响与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中出现大量嗜酸性粒细胞浸润、组织水肿等现象，经过不同剂量的黄芪甲苷干预后，组织中的嗜酸性粒细胞减少，组织结构逐渐恢复完整，其中，高剂量组的治疗效果最佳。(图1)

图1 黄芪甲苷对小鼠鼻黏膜组织病理变化的影响(×400)

2.3 黄芪甲苷对血清中相关细胞因子水平的影响与正常组比较，模型组小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1浓度显著升高(P<0.05)，而IL-10浓度显著降低(P<0.05)。与模型组比较，经过黄芪甲苷干预的小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1浓度降低，IL-10浓度升高，特别是中、高剂量组的效果更显著(P<0.05)。(表2)

表2 黄芪甲苷对小鼠血清细胞因子水平的影响

2.4 黄芪甲苷对HMGB1/TLR4/NF-κB表达的影响Western blotting检测HMGB1、TLR4、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达水平。结果显示，与正常组比较，模型组小鼠鼻黏膜组织中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与模型组和低剂量组比较，中、高剂量组的HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。(图2、图3)

图2 Western blotting检测HMGB1、TLR4和p-NF-κB的表达

注：A.HMGB1相对表达量比较；B.TLR4相对表达量比较；C.p-NF-κB相对表达量比较。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05。图3 黄芪甲苷对小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白表达的影响

3 讨论

HMGB1是一种高度保守的DNA结合蛋白，正常生理状态下存在于细胞核内，而当机体受到刺激时，被释放到细胞外，不仅可以刺激免疫系统产生多种促炎因子引起炎症反应，还参与了细胞的信号转导[15-16]。研究发现，HMGB1在AR患儿的鼻腔冲洗液中水平较高，并与AR的严重程度相关，推测HMGB1是AR的潜在治疗靶点，可通过降低其表达缓解AR[15]。Shimizu等[17]的研究结果也证实，在AR患者的鼻腔分泌物中HMGB1的浓度明显升高，其通过TLR4上调细胞分泌IL-6和IL-8的能力，参与了AR的发病。有研究报道，HMGB1可与TLR4结合，相互作用促进NF-κB的转录激活，促进促炎因子的产生和分泌[18]。NF-κB是一种转录因子，可触发TNF-α、IL-6等细胞因子的上调，从而启动炎症反应[19]。本研究结果显示，AR模型小鼠抓鼻、打喷嚏等症状明显，鼻黏膜组织炎症细胞浸润严重，血清中促炎因子浓度明显升高，而鼻黏膜组织中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白表达升高，提示在OVA的刺激下，小鼠体内HMGB1/TLR4/NF-κB通路被激活和上调，从而导致炎症反应的发生。

黄芪是一种常用中药，黄芪甲苷是黄芪的主要成分。Zhou等[12]研究结果表明，黄芪甲苷可通过TLR4/NF-κB信号通路抑制促炎因子的释放，从而抑制细胞炎症反应，改善肾间质纤维化。Leng等[20]发现，黄芪甲苷可抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的分泌，从而发挥抑制炎症反应，改善血管内皮功能障碍的作用(图4)。因此推测，黄芪甲苷可通过抑制TLR4/NF-κB通路治疗AR小鼠。在本研究中，中、高剂量黄芪甲苷干预可缓解AR小鼠症状，减少鼻黏膜组织中炎症细胞的浸润，同时也降低了血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的浓度，并使IL-10浓度升高。进一步研究其治疗相关作用机制，发现小鼠鼻黏膜组织中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白表达显著减少。

图4 黄芪甲苷作用机制[20]

本研究通过OVA诱导AR小鼠模型，黄芪甲苷对其具有较好的治疗效果，改善了AR小鼠症状及鼻黏膜组织中炎症细胞浸润，作用机制可能与其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路从而减少促炎因子产生有关，该研究结果将为AR的临床治疗提供理论基础。但本研究尚存在样本量小的缺点，后续需扩大样本量进一步研究。